[发明专利]一种测试细叶黄皮提取物抑菌活性的方法

权利要求书

1.一种测试细叶黄皮提取物抑菌活性的方法，其特征在于，该测试细叶黄皮提取物抑菌活性的方法包括：

采用纸片扩散法，测试细叶黄皮果实、叶的乙醇提取物及石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位对绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、杀螟杆菌、大肠杆菌的抑制作用；通过倾注平板法测定细叶黄皮根乙醇提取物及其石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位对绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、杀螟杆菌、大肠杆菌的抑制作用；得出了细叶黄皮果实、叶、根的乙醇提取物及其石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位对绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草杆菌及杀螟杆菌均有抑制作用。

2.如权利要求1所述的测试细叶黄皮提取物抑菌活性的方法，其特征在于，采用倾注平板法测试细叶黄皮根提取物抑菌活性的方法包括以下步骤：

步骤一，细叶黄皮根提取物的提取：把细叶黄皮根自然晾干，粉碎，用30％乙醇浸泡10天，减压蒸馏至浸膏状，得到乙醇提取物，一部分留作实验，一部分依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取，得到各部位浸膏，置4℃冰箱保存备用；

步骤二，受试液的制备，分别取细叶黄皮根乙醇提取物及其石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位，用溶剂和经灭菌处理的含5％Tween-80的蒸馏水混合，配制成系列浓度受试液，供最低抑菌浓度测定用；

步骤三，菌液的制备，分别用无菌棉签蘸取绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、杀螟杆菌、大肠杆菌接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基，于35℃下摇床培养18h，进行菌种活化；稀释活化后的菌悬液，进行活菌计数，取得最佳菌悬液浓度约为10⁶cfu·mL^-1浓度的细胞悬浮液；

步骤四，倾注平板法测定最低抑菌浓度，用移液枪吸取不同浓度的受试液各2mL，分别放于无菌空培养皿内，加入融化后的琼脂培养基13mL，最终体积为15mL，立即混匀，使受试液在培养基中的终浓度依次为40mg／mL、20mg／mL、10mg／mL、5mg／mL、2.5mg/mL、1.25mg／mL、0.63mg／mL、0.31mg／mL、0.16mg／mL；

步骤五，待凝固后，用移液枪从5种配置好的菌液中吸取100uL，放入到相应的培养皿中，然后进行均匀涂布，于35℃恒温培养，24h后观察结果；如果培养皿无菌落形成则说明有抑菌作用，开始明显长菌则说明该浓度接近MIC值。

3.如权利要求2所述的测试细叶黄皮提取物抑菌活性的方法，其特征在于，细叶黄皮根乙醇提取物及其石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位对绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、杀螟杆菌、大肠杆菌都具有较强的抑制作用，三个部位对金黄色葡萄球菌的抑制作用最强，最低抑菌剂量分别为1.25mg／mL、5.0mg／mL及2.5mg／mL；三个部位中石油醚部位对四种供试菌的最低抑菌剂量均为1.25mg／mL，其次是乙酸乙酯部位。

4.如权利要求1所述的测试细叶黄皮提取物抑菌活性的方法，其特征在于，采用纸片扩散法测试细叶黄皮果实、叶提取物抑菌活性的方法包括以下步骤：

步骤一，细叶黄皮果实、叶提取物的提取：细叶黄皮果实及叶洗净，阴干，粉碎，用30％的乙醇浸泡15天，减压蒸馏至浸膏状，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取，得到各部位浸膏；

步骤二，细菌悬液的制备，分别用无菌棉签蘸取供试菌绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、杀螟杆菌、大肠杆菌接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基，于35℃下摇床培养25h，进行菌种活化，稀释，并进行活菌计数；用无菌水将细菌分别配制成约10⁶cfu·mL^-1浓度的细胞悬浮液；

步骤三，抑菌圈的测定，把小滤纸片放入干燥培养皿中，在120℃下灭菌15min；将培养基倒入培养皿中，待培养基自然冷却凝固后，用移液枪从每种菌种吸取100uL，放入到相应的培养皿中，涂布均匀；将试药浸泡过的滤纸片置于平板内，于35℃中培养，24h后观察结果；有明显抑菌的测抑菌圈的直径。