[发明专利]以多糖作为信号放大媒介体的核酸电化学生物分析方法

说明书

技术领域

本发明属于生物分析技术领域，具体涉及以多糖作为信号放大媒介体的核酸电化学生物分析方法。

背景技术

随着科学技术的不断发展以及人们对生活质量要求的逐步提高与追求，核酸分析技术已经逐渐成为环境监测、食品安全、医药卫生，以及生物技术等领域的主要分析手段。以纳米粒子为基础的电化学分析技术成为了不可或缺的技术核心，而以此为基础发展出来的微量的和超灵敏的分析技术手段具有相当广泛的应用前景。

传统的核酸定量分析方法主要包括定磷法、定糖法、分光光度法、荧光光谱法、紫外吸收光谱法、高效液相色谱法、毛细管电泳法以及共振光散射法等，但都具有灵敏度低、选择性差、设备复杂或检测成本高等缺点，而电化学方法用于核酸的定量分析时具有灵敏度高、检测成本低、检测周期短等优良特性。

传统的信号放大策略主要包括酶促放大法、目标循环法、滚环扩增放大法、聚合酶链式反应扩增法、以及用纳米粒子进行标记等。这些方法虽然都能显著地降低核酸电化学生物分析的检测下限，但都具有操作过程复杂、检测成本高、费时、费力等缺陷。多糖作为普遍存在的生物原料，具有方便易得，成本低廉，绿色环保等特点，但对其开发并使之应用于生物分析领域的努力还处于萌芽阶段。在本方法中，结合多糖生物原料的方便易得和成本低廉，以及纳米粒子分析的高灵敏特点，开发了一种全新的核酸电化学生物分析方法。该方法简便，便利，成本低，灵敏度高，应用范围广，具有十分重要的意义。

文献10.1021/ac800334y公布了一种以多糖为模板形成银纳米线用于实现对核酸的超灵敏电学检测的方法。该方法首先在芯片表面刻划出一系列交叉指型电极，然后利用3-氨丙基三乙氧基硅烷以及对苯二异硫氰酸酯将芯片表面活化，将修饰有氨基末端的肽核酸连接到芯片表面作为捕获探针，与待测寡核苷酸片段杂交后，利用锆离子的配位化学作用将果胶分子连接到杂交形成的异源双螺旋骨架上，用高碘酸钠将果胶分子中的邻位羟基氧化成醛基，生成的醛基将银离子还原成银纳米粒子沉积在交叉指型电极间，通过检测电极间导电性的变化来实现对特异性寡核苷酸片段的定量检测。该方法的检测下限可以达到1.0fM，但其交叉指型电极制造过程复杂，捕获探针固定化过程相当繁琐，其芯片也不能重复利用，故在实际应用时有一定的局限性；此外，在实际检测时，其检测下限和检测结果的可重现性也不是相当理想。

发明内容

为解决现有技术中信号放大方法所存在的不足，本发明的目的在于提供一种以多糖作为信号放大媒介体的高灵敏核酸电化学生物分析方法。

实现本发明目的的技术解决方案为：一种以多糖作为信号放大媒介体的高灵敏核酸电化学生物分析方法，包括以下步骤：

步骤一、将金电极表面打磨至镜面，清洗干净后，在水虎鱼酸中浸泡，清洗后，在稀硫酸中对电极表面进行电化学预处理，清洗干净后用氮气吹干；

步骤二、将修饰有巯基末端的肽核酸的水溶液滴加到上述预处理过的金电极表面，进行反应，将残余的肽核酸清洗干净，用巯基己醇对电极表面进行封闭，封闭结束后冲洗干净，用氮气吹干；

步骤三、将含待测寡核苷酸片段的溶液滴加到步骤二所得的电极表面，杂交反应结束后，将未参与杂交反应的寡核苷酸片段清洗干净，用氮气吹干；

步骤四、将步骤三所得电极表面浸泡在含过渡金属离子的溶液中，反应完成后清洗干净，将多糖滴加到电极表面，反应结束后清洗干净，用氮气吹干；

步骤五、将步骤四所得电极表面浸泡在强氧化性试剂中，反应结束后清洗干净，将银离子溶液滴加到电极表面,反应结束后清洗干净，用氮气吹干；

步骤六、将步骤五所得电极表面沉积的银纳米粒子用电化学方法进行检测。

步骤一中所述的电极表面依次用0.3微米和0.05微米的氧化铝悬浮液打磨，所述水虎鱼酸中浓硫酸与过氧化氢的体积比为3:1，浸泡时间为10min，所用稀硫酸的浓度为0.5M，所述电化学预处理采用循环伏安法，其扫描电位范围为-0.2～1.5V。

步骤二中所述的肽核酸的水溶液的浓度为1.0uM，反应时间为90min，巯基己醇浓度为2.0mM，封闭时间为45min。

步骤三中所述的待测寡核苷酸片段的溶液中溶剂为pH=8.0的TE缓冲液，杂交反应时间为45～120min，其中，TE缓冲液为：10mM Tris-HCl+1mM EDTA。

步骤四中所述过渡金属离子为锆离子，其浓度为5mM，浸泡时间为45min，所述的多糖为饱和多聚半乳糖醛酸钾，反应时间为60min。