[发明专利]一种T7核酸内切酶I的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种核酸内切酶的制备方法。

背景技术

T7核酸内切酶I是一种多功能核酸酶，可特异识别并拆分重组中间体（Holiday Junction，HJ）交叉结构，随机切刻双链DNA，特异识别并切割双链DNA中的切刻和单碱基错配位点。

该酶蛋白是T7噬菌体基因3编码产物，由包含149个氨基酸残基的多肽链构成，两条肽链通过结构域交换形成同源二聚体，其催化中心由来自两个亚基的氨基酸侧链共同组成，两个催化结构域可以独立作为DNA切刻酶；通过结构域之间的协同作用，表现出结构特异性催化。作为一种已知的噬菌体类解离酶，该酶可以剪切分叉DNA，随机切刻线性DNA，识别并切刻nicked-DNA位点，识别单碱基错配位点，T7核酸内切酶I对HJ的结合具有高度特异性，其结合HJ的能力是结合线性双链DNA的1000倍左右，还具备随机在双链DNA中引入切刻位点的活性，专一性识别切刻位点并在另一条DNA链上对应位置引入另一切刻位点导致DNA双链的断裂，专一性识别并切割DNA双链中的单碱基错配位点。该酶应用广泛，具有作为工具酶的重要价值。主要的商业用途包括：可用于分支DNA结构的解离，基因组测序技术和DNA-shuffling技术中DNA的前处理，SNP的检测等。

目前制备T7核酸内切酶的方法是：将蛋白分别表达合成出两段肽链，在体外融合而成。采用IMPACT-TWIN蛋白纯化系统纯化与MBP融合表达的截短型无活性T7核酸内切酶I（tT7Endo I），该融合蛋白的C-端带有硫酯键。然后体外合成一段合成肽，其中含有被前者截下来的氨基酸，将该合成肽与融合蛋白的C-端硫酯键相连接，形成全长具有活性的T7核酸内切酶I。最后，再用因子Xa将MBP融合头切去，纯化得到全长的野生型T7核酸内切酶I。

发明内容

本发明的目的在于提供一种核酸内切酶的制备方法，该方法操作简便、易于规模化生产，并能有效节约成本。

本发明所述的一种T7核酸内切酶的制备方法，包括以下步骤：

（a）T7核酸内切酶的表达载体的构建；

（b）将不含有终止密码子的编码序列插入到步骤a所获得的蛋白表达载体中；以及

（c）采用与标签相适应的纯化方法，获得目标蛋白质即T7核酸内切酶。

根据本发明所述的T7核酸内切酶的制备方法的进一步特征，所述表达载体包括：用于插入目的蛋白即T7核酸内切酶的编码序列的识别和切割位点；在所述识别和切割位点的上游具有如SEQ ID NO:1所示的gIIIs信号肽编码序列，其前面是起始密码子；在所述识别和切割位点的下游具有His6标签，其后面是终止密码子。

优选地，所述的识别和切割位点为BsaI识别及切割位点。

本发明的优点在于：构建N端带M13噬菌体蛋白III的前导序列（gIIIs）的载体，合成出来的信号肽能引导蛋白分泌出核外，在细胞周质中表达，对细胞本身的基因组无毒性，故能直接在体内表达出可溶并有生物活性的T7核酸内切酶I。这种生产方法简便易操作，易于规模化生产，并能有效节约成本。

经实验表明，本发明所述方法获得的T7核酸内切酶I能特异地识别DNA片段中不匹配的位点，并在这此位点附近进行切割。其切割效率与商品化的T7核酸内切酶I相当，活性良好。相比于现有技术，本发明所述方法操作更为简便、易于规模化生产，并能有效节约成本。

附图说明

图1是T7核酸内切酶I的NI柱层析电泳图；图中，S：层析前样品；X：穿过样品；Elution：线性洗脱收集峰。

图2是T7核酸内切酶I的Heparin柱层析电泳图；图中，S：层析前样品；X：穿过样品；Elution：线性洗脱收集峰。

图3是T7核酸内切酶I的Hitrap SPP柱层析电泳图；图中，S：层析前样品；X：穿过样品；Elution：线性洗脱收集峰。

图4是反应产物用于琼脂糖凝胶电泳图；图中，M：100-3000bp DNA Marker；1：加入NEB T7核酸内切酶I（NEB Catalog#M0302）的阳性对照；2：加入纯化后的T7核酸内切酶I；3：不加任何酶，加入ddH2O作为阴性对照；圆点：T7核酸内切酶I识别后切开所形成的条带，长度分别在480bp及330bp左右。

具体实施方式