[发明专利]一种发酵唾液乳酸杆菌提取胆盐水解酶的方法

说明书

技术领域

本发明公开了一项利用超声波进行细胞破壁结合硫酸铵沉淀提取唾液乳酸杆菌中胆盐水解酶的方法，所得BSH制品适用于在功能性乳制品中作为功能因子，开发生产新型的功能食品。

背景技术

血清中高胆固醇含量是诱发高血压、冠心病等心血管疾病的重要因素。研究发现，不同种类的益生菌都具有降低胆固醇的作用，这种作用与其所产生的胆盐水解酶(Bile salt hydrolase，BSH，EC 3·5·1·24)密切相关。

BSH酶广泛存在于肠道微生物中，在其它环境的微生物中较少被发现。目前，很多BSHs酶已经从多种微生物中得以纯化和鉴定。在被常规认作益生菌的乳酸菌、双歧杆菌和部分肠道共生菌，如类菌体梭菌、肠球菌等细菌中都发现存在BSH活性。目前为止，尚未在生活环境缺乏胆盐的细菌中发现具有BSH活性的菌株。除了两株类菌体以外的BSH活性阳性细菌均为革兰氏阳性菌。在其他所有肠道革兰氏阴性菌中，包括大肠杆菌Escherichia coli以及肠道沙门氏菌Salmonella enterica等均未发现BSH活性，也没有找到BSH同源基因。

胆盐水解酶是由BSH基因编码的一种胞内酶，是肠道微生物为了抵抗胆盐得以生存而产生的一种代谢产物，该酶能够水解肠道内的结合胆盐形成氨基酸和游离胆汁酸，经BSH酶作用后产生的去结合型胆盐比结合型胆盐重吸收效率低，导致大量的去结合型胆盐从粪便中排出，而胆固醇的主要去路是转变成胆酸，因此通过胆盐水解酶的水解作用可以使胆固醇不断向合成结合胆盐的方向进行以保证肠道内结合胆盐与脂质物质的平衡，从而消耗体内更多的胆固醇，达到降低血清胆固醇的目的。

虽然目前BSH酶对宿主细胞的作用没有公认的结论，也存在各种假说，如降低胆固醇，减弱脂肪酸和甘油一酯酸的吸收等等。但国内外大量临床实验证实，服用益生菌及其相关制品具有减少人体血清胆固醇含量，降低心血管疾病发病率的功效，这与益生菌产生的胆盐水解酶BSH可能存在密切的联系。正常人胆汁中的胆汁酸按结构可分为两大类：一类为游离型胆汁酸，包括胆酸、脱氧胆酸、鹅去氧胆酸和少量的石胆酸；另一类为结合型胆汁酸，主要包括甘氨胆酸、甘氨鹅去氧胆酸、牛磺胆酸及牛磺鹅去氧胆酸等。根据资料显示，人体内六种主要的结合胆盐和三种胆酸分别参与了不同的代谢活动，通过激活不同的信号传导途径，可以分别起到调节体内能量代谢平衡、控制肥胖的作用以及抑制肠道细菌过度增殖等作用。其中，甘氨胆酸能够显著抑制IgM、IgG 的含量，并增加IL- 2及TNF-A的含量，提高CD4+/ CD8+比值，提高非特异体性免疫功能。De Boever 等人猜测甘氨与牛磺脱氧胆酸的对胆酸的高效率解离可能是使胆汁酸的毒性降低的重要原因。甘氨鹅脱氧胆酸可诱导原代培养的大鼠肝细胞凋亡，这为临床治疗胆汁淤积性肝病提供了新的思路和理论基础。牛磺鹅脱氧胆酸可通过减少NO、LTB4的产生，直接发挥抗炎作用。此外David A. Wenger等人发现牛磺鹅脱氧胆酸能够促进乳糖苷神经酰胺β-半乳糖苷酶的活性，这对研究克拉贝氏病具有指向性意义。因此，通过胆盐水解酶的水解作用，影响胆汁酸的组成和流量对于治疗高胆固醇相关的糖尿病、肥胖症等许多疾病，维护人类健康有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种乳酸菌胆盐水解酶及其提取方法。

本发明所提供的乳酸菌胆盐水解酶的提取方法是由唾液乳酸杆菌得到的胆盐水解酶。

(1) 乳酸菌发酵液以8 000 r/min，4 °C离心8 min，收集沉淀菌泥；

(2) 用生理盐水离心洗涤菌体沉淀2次(条件同上)；

(3) 加入0.02 mol/L的磷酸盐缓冲液(pH 6.0)至发酵液原体积，细胞悬浮液于冰浴中进行超声波破碎15 min(功率400~450 w，工作1 s，间歇2 s)；

(4) 以10 000 r/min，4 °C离心10 min除去细胞碎片，收集含酶上清液。

(5) 上清液用70%~75%饱和浓度的硫酸按于4 °C盐析24 h，以10 000 r/min，4 °C离心15~20 min，收集沉淀的蛋白物质；

(6) 用0.02 mol/L的磷酸盐缓冲液(pH 6.0)溶解蛋白物质，再以预处理的透析袋于4 °C透析至透析液经BaC12检验无沉淀为止，透析液即为胆盐水解酶提取液。