[发明专利]增强型DCIK细胞制备方法及其细胞制剂

说明书

技术领域

本发明涉及免疫细胞体外培养领域，具体地指一种增强型DCIK细胞制备方法以及细胞制剂。

背景技术

过继性细胞免疫治疗是指通过输注自身或同种特异性、非特异性抗肿瘤免疫效应细胞，直接杀伤肿瘤细胞或病毒的治疗方法。过继性细胞免疫治疗己进入临床应用，并成为继手术、放疗、化疗后的第四大肿瘤治疗方法。此类免疫细胞的种类包括了淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)，肿瘤侵润淋巴细胞(TIL)，细胞毒淋巴细胞(CTL)等，在众多的免疫细胞中，树突状细胞（DC）作为新一代肿瘤疫苗的研究和应用成为近年来主动免疫治疗研究中的热点。在机体免疫反应中，DC是最主要的抗原提呈细胞，具有捕获、加工处理抗原和向T淋巴细胞提呈抗原分子、表达共刺激分子、释放细胞因子和白细胞介素等特性。因此，DC在肿瘤细胞免疫应答中其主要免疫调节作用，是肿瘤主动特异性免疫最重要的免疫辅助细胞。

当DC与CIK共培养时，彼此能够互相作用诱导出比CIK细胞有更强的增殖活性、更高肿瘤细胞杀伤活性的细胞群。但是这种细胞对恶性细胞的攻击与CIK细胞一样缺乏抗原特异性。当细胞经用肿瘤相关抗原冲击后用肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）共培养时，诱导出的效应细胞具有明显的对恶性细胞的特异性攻击的能力，但这种免疫效应细胞扩增能力有限，且TIL来源困难。

与其它免疫细胞相比，DCIK细胞是己知的对肿瘤细胞杀 伤活性最强的效应细胞之一。它是通过多种细胞因子的联合作用，由外周血单个核细胞培养而来的一群异质细胞。DCIK细胞的数量和细胞毒活性直接决定了其在临床治疗中的效果。

发明内容

本发明所要解决的技术问题就是提供一种制备增强型DCIK的方法，所述增强型DCIK细胞为经由外周血单个核细胞（PBMC)通过体外诱导、扩增培养成细胞因子诱导的杀伤细胞。

本发明还同时提供了基于此种增强型DCIK细胞的制剂，将该制剂施予单个核细胞来源的人体，达到增强免疫力，治疗肝炎、癌症、感染等疾病的作用。

为解决上述技术问题，本发明提供的一种增强型DCIK细胞的制备方法，包括以下步骤：

1）从采集患者的外周血中分离得到外周血单个核细胞；将其置于无血培养基中调整细胞浓度3×10⁶/ml的单核细胞，转移至培养瓶中，在温度为37℃、5%CO₂、饱和湿度条件下培养2-3h后，轻轻吹打使之未贴壁的细胞重悬，并转移至新的培养瓶中用于CIK细胞的培养，原瓶加入含有IL-4和GM-CSF的培养液继续培养，第3天进行半量换液，第5天添加TNF-α诱导细胞成熟，第7天收货成熟的DC细胞加入CIK细胞的培养袋中进行混合培养；用无血清培养基重悬培养DC细胞时余下的细胞，得到浓度1～3×10⁶/ml的单个核细胞，加入IFN-γ、植物血凝素和PGE2、并转移至培养瓶或培养袋中，在温度为37℃、5%CO₂、饱和湿度条件下培养24h；其中：所述IFN-γ的浓度：100～2000u/ml，PHA的浓度：10ng～50μg/ml，PGE2的浓度：1ng～50μg/ml；

2）然后加入CD3单抗，IL-2和IL-1α，继续培养；其中，CD3单抗的浓度：1ng～20μg/ml，IL-2的浓度：10～10000IU/ml，IL-1α的浓度：1ng～50μg/ml；

3）培养3～5天后，添加含有IL-2无血清培养基，控制细胞密度在1～6×10⁶/ml，其中：所述IL-2的浓度：10～10000IU/ml；

4）第7天开始每隔2-3天对培养的细胞进行计数，并根据细胞浓度添加含有IL-2和亚硒酸钠的无血清培养基，连续培养第14～21天后，离心收集得到增强型CIK细胞，其中：所述IL-2的浓度为10～10000IU/ml，亚硒酸钠的浓度为1μg～1mg/L。

进一步地，所述增强型DCIK细胞的浓度：1～6×10^6-8/ml

再进一步地，包括以下步骤：