[发明专利]增强型DCIK细胞制备方法及其细胞制剂

权利要求书

1.一种增强型DCIK细胞的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

1）从采集患者的外周血中分离得到外周血单个核细胞；将其置于无血培养基中调整细胞浓度3×10⁶/ml的单核细胞，转移至培养瓶中，在温度为37℃、5%CO₂、饱和湿度条件下培养2-3h后，轻轻吹打使之未贴壁的细胞重悬，并转移至新的培养瓶中用于CIK细胞的培养，原瓶加入含有IL-4和GM-CSF的培养液继续培养，第3天进行半量换液，第5天添加TNF-α诱导细胞成熟，第7天收货成熟的DC细胞加入CIK细胞的培养袋中进行混合培养；用无血清培养基重悬培养DC细胞时余下的细胞，，得到浓度1～3×10⁶/ml的核细胞，加入IFN-γ、植物血凝素和PGE2、并转移至培养瓶或培养袋中，在温度为37℃、5%CO₂、饱和湿度条件下培养24h；其中：所述IFN-γ的浓度：100～2000u/ml，PHA的浓度：10ng～50μg/ml，PGE2的浓度：1ng～50μg/ml；

2）然后加入CD3单抗，IL-2和IL-1α，继续培养；其中，CD3单抗的浓度：1ng～20μg/ml，IL-2的浓度：10～10000IU/ml，IL-1α的浓度：1ng～50μg/ml；

3）培养3～5天后，添加含有IL-2无血清培养基，控制细胞密度在1～6×10⁶/ml，其中：所述IL-2的浓度：10～10000IU/ml；

4）第7天开始每隔2-3天对培养的细胞进行计数，并根据细胞浓度添加含有IL-2和亚硒酸钠的无血清培养基，连续培养第14～21天后，离心收集得到增强型DCIK细胞，其中：所述IL-2的浓度为10～10000IU/ml，亚硒酸钠的浓度为1μg～1mg/L。

2.根据权利要求1所述的增强型DCIK细胞的制备方法，其特征在于：所述增强型DCIK细胞的浓度：1～6×10^6-8/ml。

3.根据权利要求2所述的增强型DCIK细胞的制备方法，其特 征在于：包括以下步骤：

1）从采集患者的外周血中分离得到外周血单个核细胞；将其置于无血培养基中培养，得到浓度1×10⁶/ml的核细胞，加入IFN-γ、植物血凝素和PGE2、并转移至培养瓶或培养袋中，在温度为37℃、5%CO₂、饱和湿度条件下培养24h；其中：所述IFN-γ的浓度：2000IU/ml，PHA的浓度：100ng/ml，PGE2的浓度：500μg/ml；

2）然后加入CD3单抗，IL-2，IL-1α，IL-4和GM-CSF，继续培养；CD3单抗的浓度：20μg/ml，IL-2的浓度：1000IU/ml，IL-1α的浓度：50ng/ml；

3）培养3～5后，添加含有IL-2无血清培养基，控制细胞密度在1×10⁶/ml，其中：所述IL-2的浓度：1000IU/ml；

4）第7天开始每隔2～3天对培养的细胞进行计数，并根据细胞浓度添加含有IL-2和亚硒酸钠的无血清培养基，连续培养第14～21天后，离心收集得到增强型DCIK细胞，其中：所述IL-2的浓度为1000IU/ml，亚硒酸钠的浓度为100μg/L。

4.一种增强型DCIK细胞制剂，包括利用权利要求1～3中任意一项所述的增强型DCIK细胞的制备方法得到的增强型DCIK细胞、人血白蛋白、IL-2、氨基酸、维生素和无机盐。

5.根据权利要求4所述的增强型DCIK细胞制剂，其特征在于：所述人血白蛋白浓度：1～300g/L、IL-2的浓度：l～9×10^5～7U/ml、氨基酸浓度：50mg～10g/L、维生素浓度：100ug～50mg/L、无机盐浓度：500mg～10g/L。

6.根据权利要求4或5所述的增强型DCIK细胞制剂，其特征在于：所述人血白蛋白浓度：50～200g/L、IL-2的浓度：l～9×10^5～6U/ml、氨基酸浓度：500mg～5g/L、维生素浓度：1～30mg/L、无机盐浓度：1g～7g/L。