[发明专利]一组用于水禽细小病毒可视化鉴别诊断的荧光定量引物

说明书

技术领域

  本发明属于动物分子病原学领域，具体涉及一组用于水禽细小病毒可视化鉴别诊断的荧光定量引物。

背景技术

鹅细小病毒( Goose parvovirus，GPV) 是感染禽类的主要自主复制型细小病毒，由我国学者方定一于1956年首先在江苏省扬州地区发现（方定一．小鹅瘟的介绍[J]．中国兽医学杂志，1962，8：19-20．]，以后在许多国家也分离到该病毒，世界禽类学会为纪念匈牙利学者Derzsy的先进工作而将此病命名为Derzsy^’s病（万春和，朱海侠，黄瑜，等．一株鹅细小病毒全基因特征分析[J]．中国动物传染病学报，2011，1,9（4）：19-24．）。

鹅细小病毒属于细小病毒科、细小病毒属，只有一个血清型。该病主要侵害30d以内的雏鹅和雏番鸭，引起以急性肠炎及肝、肾、心等实质脏器败血性病变，尤其是小肠部位的纤维性、栓塞性病变，是目前危害养鹅业健康发展的最严重的传染病之一，造成了严重的经济损失，引起国内外学者的广泛重视。

番鸭细小病毒病又叫 “三周病”，是由番细小病毒（Muscovy duck parvovirus，MDPV）引起的一种急性、败血性传染病，其特点是具有高度传染性和死亡率。主要发生于3周龄以内的雏番鸭，病变的主要特征是肠道严重发炎，肠黏膜坏死，脱落，肠管肿脓、出血。本病可造成雏番鸭大批死亡，即使耐过也成僵鸭。

目前，关于鹅细小病毒和番鸭细小病毒病原学检测的实时荧光定量PCR方法均有相关报道。其中关于鹅细小病毒和番鸭细小病毒病原学检测的实时荧光定量PCR方法都是根据鹅细小病毒和番鸭细小病毒基因组特征分别设计引物，分别进行实时荧光定量PCR来进行诊断。

鹅细小病毒对雏鹅和雏番鸭均易感，在临床上对番鸭感染细小病毒的检测时，由于鹅细小病毒和番鸭细小病毒基因组NS基因同源性较高，PCR实验结果可能会造成假阳性扩增。目前，对GPV和MDPV感染情况用实时荧光定量PCR方法需分别进行实时荧光定量PCR反应，成本较高。

目前，国内外还没有仅需一组实时荧光定量PCR引物同时对GPV和MDPV感染情况进行可视化鉴别诊断的相关研究报道，本发明的建立可填补国内外相关领域空白。

发明内容

本发明的目的在于提供一组用于水禽细小病毒可视化鉴别诊断的荧光定量引物及其检测方法，该方法能有效区分鹅细小病毒（GPV）和番鸭细小病毒（MDPV）感染（或共感染），为番鸭健康养殖提供技术保证。

本发明根据鹅细小病毒和番鸭细小病毒基因组中NS基因特征，设计一组实时荧光定量PCR引物，该引物针对鹅细小病毒和番鸭细小病毒进行PCR扩增可得到特异性目的条带，用常规PCR无法对GPV和MDPV感染情况进行鉴别诊断，对其扩增的GPV和MDPV基因在该区域存在有GC含量差异，通过建立基于SYBR  GreenⅠ实时荧光定量PCR对GPV和MDPV反应后的溶解曲线存在不同的特异峰，根据溶解曲线的特异峰的差异可直接对GPV和MDPV感染情况进行可视化观察。

本发明采用以下技术方案：

一组用于水禽细小病毒可视化鉴别诊断的荧光定量引物，所述PCR引物P1和P2的序列为：上游引物P1：5’- TTCTTTGCTGCTCTGTTGGAAATA -3’，

下游引物P2：5’- GCTTTTACCAATATGCC -3’。

通过所述引物建立基于SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法，根据利用该引物扩增的鹅细小病毒（GPV）和番鸭细小病毒（MDPV）特异基因片段区域核苷酸GC含量的差异导致溶解曲线温度Tm值的差异，根据溶解曲线Tm值的差异可直接对GPV和MDPV感染进行定量检测。

具体包括以下步骤：

（1）提取鹅细小病毒GPV和番鸭细小病毒MDPV基因组DNA；

（2）用所述实时荧光定量引物P1和P2同时对GPV和MDPV进行基于SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测，反应完成后作出溶解曲线；

（3）实时荧光定量PCR反应结束后，根据溶解曲线特异性峰值的差异直接对鹅细小病毒和番鸭细小病毒感染情况进行可视化检测。

所述PCR引物在检测鹅细小病毒和番鸭细小病毒感染情况方面的应用。

其中，实时荧光定量PCR引物需满足如下要求：