[发明专利]定点突变的戊型肝炎病毒结构蛋白及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物医学的基因工程技术领域，具体涉及定点突变的戊型肝炎病毒结构蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

戊型肝炎病毒（hepatitis E virus,HEV）是一种严重危害人类健康的肝炎病毒，它主要经粪–口途径传播（污染的水源），引起的急性戊型肝炎（hepatitis E,HE）分布于世界许多国家，最常见于亚洲和非洲不发达国家。HEV在我国流行方式主要有暴发流行和散发两种。我国戊型肝炎大暴发规模最大的一次发生于1986-1988年的新疆，共发病119280例，死亡707人，其中414名为孕妇。散发病例主要在城市流行，我国人群HEV感染率约为17.2％，散发流行具有明显的春冬季高峰。HEV除了引起急性戊型肝炎外，最近报道若病人为器官移植术后或HIV携带者等免疫缺陷患者，亦可转为慢性戊型肝炎。在60岁以上的老人中戊型肝炎的发病率逐渐上升，表现出病情重，病程长，病死率高，并发症多，重度黄疸比例高的老年戊型肝炎特点。HEV感染在我国已经构成严重的公共卫生问题，研发高保护性的疫苗和高灵敏度特异性的诊断试剂尤为迫切。

HEV是单股正链的RNA病毒，电镜下HEV是直径27～34nm球形颗粒，呈20面体立体对称，无包膜，病毒衣壳表面有突起。基因组全长大约7200个核苷酸，具有3个互相重叠的开放读码框架(open reading frame，ORF)。其中ORF2编码660个氨基酸的衣壳蛋白，功能是完成病毒粒子的组装、与宿主细胞的吸附、刺激机体产生中和抗体，是目前疫苗研发的主要靶点。pORF2有三个潜在的糖基化位点（Asn-137、Asn-310和Asn-562），在真核细胞表达系统中表达时，Asn-137、Asn-310和Asn-562残基进行糖基化修饰。pORF2可分为三个结构域，S domain（128～319aa）、M domain（320～455aa）和P domain（456～606aa）。从pORF2晶体衍射结构来看，P domain以二聚体的结构形式组成病毒衣壳表面的突起，Asn-562潜在的糖基化位点正好处于P domain突起顶部的中心位置，此位置是病毒粒子与细胞粘附和产生中和抗体的部位。如果Asn-562发生糖基化，那么形成的糖链对P domain二聚体的形成、抗原性和免疫原性以及中和抗体的产生会带来什么样的影响，目前为止未见有报道。反之将Asn-562糖基化位点进行定点突变，Asn-562糖基化位点突变体的生物学功能还未见报道。

由于HEV不能有效地进行细胞培养，故无法制备其减毒或灭活疫苗，目前国内外学者多采用基因工程技术在原核或真核表达系统中研发重组戊型肝炎疫苗。近年来，酵母表达系统以其高稳定﹑高表达﹑高分泌等特点得到广泛利用。酵母属于低等真核微生物。当前对酵母特性和遗传背景的研究较清楚：①基因重组易操作②易于在营养成份简单的培养基中高密度发酵培养，适于工业化生产③具有分泌型表达模式，正确的折叠和修饰④发酵液中杂蛋白少，产物易于纯化，无热原和其它病原体，且不含癌基因，表达产物的安全性高。目前全世界大规模生产和使用的乙型肝炎疫苗也是由酵母表达系统的产物制成。因此如何利用酵母表达系统生产高表达水平、低成本的基因工程疫苗对我国的戊型肝炎流行控制十分重要。

HEV在体外不能大量细胞培养，组装成为有功能的病毒粒子衣壳蛋白的pORF2是糖基化还是非糖基化形式，目前还不明确。如果Asn-562发生糖基化，那么形成的糖链对P domain二聚体的形成、抗原性和免疫原性以及中和抗体的产生会带来什么样的影响，目前为止未见有报道。反之将Asn-562糖基化位点进行定点突变，Asn-562糖基化位点突变体的生物学功能还未见报道。

发明内容

发明目的：为解决上述问题，本发明在酵母表达系统中表达含有Asn-562糖基化位点的ORF2p179（439-617aa），并设计针对Asn-562糖基化位点的突变体，来研究糖基化p179与点突变的p179在二聚体的形成﹑抗原性﹑免疫原性以及中和抗体的产生等方面的改变。以深入了解HEV结构蛋白中保护性中和表位的结构特征，因为只有深入了解HEV结构蛋白中保护性中和表位的结构特征，才能研发出高保护性的疫苗和高灵敏度特异性的诊断试剂。

本发明的第一个目的是提供了一种戊型肝炎病毒结构蛋白ORF2的第439～617位氨基酸中第562位氨基酸的定点突变体。本发明第二个目的是提供一种重组质粒。本发明的第三个目的是提供了一种基因工程菌株。本发明的第四个目的是提供了一种戊型肝炎病毒结构蛋白的制备方法。