[发明专利]一种将外源基因转入菊花或近缘种进行瞬时表达的方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种通过农杆菌注射渗透法将外源基因转入菊花或近缘种进行瞬时表达的方法。

背景技术

菊花(ChrysanthemummorifoliumRamat.)，原产中国，属于菊科菊属宿根性多年生草本花卉，在我国已有3000多年的栽培历史,是中国十大名花之一，同时它也是世界四大切花之首，占全球切花数量的30%(洪波等，2009)。菊花观赏价值高，近年来在绿化美化中的应用越来越多，是一种大众消费型花卉，急需加大菊花品种选育及创新工作的进度（朱明涛等，2011），从而提供良好的经济效益和社会效益。但是，受到物种自身基因的限制，传统育种方法难以获得成功，虽然远源杂交取得了一些成果，但也不可能随意引入需要的基因。转基因技术为菊花育种提供了全新的思路和途径。

根癌农杆菌介导转基因是研究菊花基因功能和获得遗传修饰有机体的最常用手段之一。随着研究的进行，发现由于菊花遗传背景的复杂性，大量的外源基因在菊花中没有获得预期表达，该传统的遗传转化方法在菊花中的应用受到较大的限制（于鑫等，2009）。

农杆菌介导的瞬时表达方法是近年来发展形成的一种快速有效的分析蛋白质表达的方法，与传统的转基因过程相比较，具有周期短、安全高效、操作简易、费用相对较低、转化效率高、能同时感染多个品种的优点。目前该方法已经在许多植物组织中取得了成功，如烟草叶片、拟南芥叶片、月季花瓣、半夏无菌叶片、番茄叶片和果实、葡萄叶片等。但是在菊花中进行表达存在转化效率低、外源基因表达量低、嵌合体株率高及再生过程中基因沉默等问题；外植体的选择、抗生素的确定、易感菌株的选用、共培养条件等对转化效率起着决定性作用，且存在操作繁琐、周期长的问题，通常需要4-6个月，综合菊花转基因的成功案例中不同菌株的使用情况，遗传转化率低下，一般在5-40%（Teixeiraetal.，2013）。

发明内容

本发明提供一种将外源基因转入菊花及近缘种中进行瞬时表达的方法，以农杆菌介导，通过构建植物表达载体pORER1-2×35s:gus，使外源基因GUS在菊花及近缘种进行瞬时表达，解决了目前农杆菌转化菊花遗传转化周期长、效率低的问题，为更有效地筛选和分析菊花基因功能、蛋白质定位及进一步获得稳定转化子提供了可能。

为实现上述目的，本发明采用了以下技术手段：

一种将外源基因转入菊花或菊花近缘种进行瞬时表达的方法，通过农杆菌注射渗透法将含有GUS基因的瞬时表达载体转入菊花及菊花近缘种叶肉细胞中，经培养，使GUS基因在叶片中表达。

一种将外源基因转入菊花或菊花近缘种进行瞬时表达的方法，作为优选，瞬时表达载体为携带35s启动子及终止子，小于10kb的过量表达载体质粒。

一种将外源基因转入菊花或菊花近缘种进行瞬时表达的方法，包括如下步骤：

（1）植株的获得：采用生根后30d-50d，有完全展开叶10-14片的菊花扦插苗；选取扦插苗中上部完全展开叶进行标记，以备注射；

（2）植物表达载体pORER1-2×35s:gus的构建：设计引物分别为上游引物2×35S-Sac-F:SEQIDNO.2，下游引物2×35S-Nhe-R:SEQIDNO.3，以pCAMBIA1301质粒DNA为模板，用高保真酶进行PCR扩增反应，在pCAMBIA1301质粒DNA上游和下游分别引入SacⅡ和NheI酶切位点，PCR产物回收；PCR产物与SacⅡ和NheI双酶切后的pORER1载体连接，转化TOP10感受态细胞，提取阳性质粒，植物表达载体pORER1-2×35s:gus构建成功；

（3）侵染液制备：将pORER1-2×35s:gus转入农杆菌中；挑取单克隆，PCR电泳检测，选取正确构建质粒的单克隆阳性农杆菌转入YEB液体培养基中，过夜轻摇培养16～20h，同时摇菌P19；把摇好的两种菌液进行常温离心，去上清，收集菌体，分别用侵染缓冲液重悬；将含有正确构建质粒的阳性农杆菌菌液与P19等体积混合，然后将混合菌液常温轻摇培养至少3小时；

（4）菊花叶片的制备：于叶片近轴端主叶脉中部两侧无叶脉处点刻伤或十字刻伤，伤口只需透过叶表皮，不可穿透叶片；

（5）叶片转化：以去除针头的注射器优选的为2ml注射器吸取步骤3）制备的侵染液，出水口对准刻伤处，缓推注射器活塞，同时手指轻压刻伤处对应的叶片远轴端位置，以使侵染液渗透入叶片背面，重复数次以使侵染液尽可能蔓延至整个叶片，标记下注射的叶片对应区域；