[发明专利]一种将外源基因转入菊花或近缘种进行瞬时表达的方法

权利要求书

1.一种将外源基因转入菊花或菊花近缘种进行瞬时表达的方法，其特征在于：通过农杆菌注射渗透法将含有GUS基因的瞬时表达载体转入菊花及菊花近缘种叶肉细胞中，经培养，使GUS基因在叶片中瞬时表达。

2.权利要求1所述的将外源基因转入菊花或菊花近缘种进行瞬时表达的方法，其特征在于：瞬时表达载体为携带35s启动子及终止子，小于10kb的过量表达载体质粒。

3.权利要求2所述的将外源基因转入菊花进行瞬时表达的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

（1）植株的获得：采用生根后30d-50d，有完全展开叶10-14片的菊花扦插苗；选取扦插苗中上部完全展开叶进行标记，以备注射；

（2）植物表达载体pORER1-2×35s:gus的构建：设计引物分别为上游引物2×35S-Sac-F:SEQIDNO.2，下游引物2×35S-Nhe-R:SEQIDNO.3，以pCAMBIA1301质粒DNA为模板，用高保真酶，进行PCR扩增反应，在pCAMBIA1301质粒DNA上游和下游分别引入SacⅡ和NheI酶切位点，PCR产物回收；PCR产物与SacⅡ和NheI双酶切后的pORER1载体连接，转化TOP10感受态细胞，提取阳性质粒，植物表达载体pORER1-2×35s:gus构建成功；

（3）侵染液制备：将pORER1-2×35s:gus转入农杆菌中；挑取单克隆，PCR电泳检测，选取正确构建质粒的单克隆阳性农杆菌转入YEB液体培养基中，过夜轻摇培养16～20h，同时摇菌P19；把摇好的两种菌液进行常温离心，去上清，收集菌体，分别用侵染缓冲液重悬；将含有正确构建质粒的阳性农杆菌菌液与P19等体积混合，然后将混合菌液常温轻摇培养至少3小时；

（4）菊花叶片的制备：于叶片近轴端主叶脉中部两侧无叶脉处点刻伤或十字刻伤，伤口只需透过叶表皮，不可穿透叶片；

（5）叶片转化：以去除针头的注射器优选的为2ml注射器吸取步骤3）制备的侵染液，出水口对准刻伤处，缓推注射器活塞，同时手指轻压刻伤处对应的叶片远轴端位置，以使侵染液渗透入叶片背面，重复数次以使侵染液尽可能蔓延至整个叶片，标记下注射的叶片对应区域；

（6）叶片转化后培养：将转化后的扦插苗用保鲜膜封闭保湿，置于黑暗中培养1.5-2d，然后再转入光下培养2-3d，获得转化后的活体植株；

（7）阳性转化叶片检测：以X-Gluc染色反应液浸没标记叶，过夜染色后脱色至透明状后，观察叶片GUS染色状况；设计GUS基因引物：上游引物GUS-RT-F:SEQIDNO.4，下游引物GUS-RT-R:SEQIDNO.5，选取标记叶片提取RNA，并反转录为cDNA，以cDNA为模板PCR扩增检测阳性转化叶片中GUS的表达。

4.权利要求3所述的将外源基因转入菊花或菊花近缘种进行瞬时表达的方法，其特征在于，上述反应步骤2)中高保真酶采用TaKaRa的PrimeSTAR^TMHSDNAPolymerasePCR；产物以凝胶回收试剂盒回收，采用热激法转化TOP10感受态细胞；PCR反应体系，50μL含有：10×HSRCRBuffer5.0μL，2×35S-Sac-F、20μmol·L^-的¹2×35S-Nhe-R引物各1.0μL，2.5mmol·L^-1的dNTPmix4.0μL，PrimeSTAR^TMHSDNAPolymerase0.4μL，DNA模板1μL，ddH₂O37.6μL；反应程序：95℃预变性4min，然后94℃解链30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min30sec，反应30个循环，72℃延伸10min。