[发明专利]大肠杆菌O157:H7的LAMP检测引物及检测试剂盒

说明书

 

一、技术领域

本发明涉及检测大肠杆菌O157:H7的LAMP引物及检测试剂盒，属于生物和食品检测领域。

二、背景技术

大肠杆菌（Escherichia coli, E.coli）O157:H7是重要的食源性病原菌，能够在全世界范围内引起动物、家禽和人类爆发感染，不仅关乎食品安全，而且与医疗和公共卫生问题密切相关。

现如今，许多报道尝试研制更特异的方法检测E.coli O157:H7。传统的培养鉴定技术使用选择性培养基或者显色平板检测E.coli O157:H7，但是这种方法费时，费力，准确性差。 PCR技术和定量PCR检测技术已经被广泛应用各检测领域，发挥着不可忽视的作用，但对仪器设备等要求较高，不适合快速和临床样品的检测。我们前期研究工作中，通过对已有E.coli O157:H7全基因组序列生物信息学，比对分析，发现新的阅读框编码鞭毛类基因，它唯一的存在于E.coli O157:H7基因组中，为适应更广泛领域检测的需要，有必要建立新型的检测技术。

环介导等温扩增技术（LAMP）是由日本学者T.Notomi发明的一种新型核酸扩增技术。该技术依赖于4条特异设计的引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，在等温条件下可以高效、高特异性地扩增靶序列。近年来，国内外已经将该技术广泛应用于病原检测，如LAMP可以检测多种病原菌，例如沙门氏杆菌、李氏杆菌、大肠杆菌等。目前未见能够特异性和专一性检测大肠杆菌O157:H7 LAMP的报道。

本发明的大肠杆菌O157:H7 LAMP检测技术避免了现有检测手段存在的某些问题，相比较其他检测手段，建立的大肠杆菌O157:H7 LAMP方法具有敏感性高、特异性强、检测周期短、操作简单方便的特点。

 

三、发现内容

技术问题  本发明目的在于克服现有技术的不足，提供一种特异性检测大肠杆菌O157:H7 LAMP检测试剂盒及其检测方法。本发明的试剂盒使用方便，结果鉴定直观，检测敏感性和特异性高，并且易于大范围推广使用。

技术方案  

本发明是通过以下技术方案实现的。

本发明设计一种大肠杆菌O157:H7 LAMP检测试剂盒，该试剂盒包括以下4条引物，所述引物序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

所述试剂盒包括反应液A和SYBR Green I，所述反应液A具体包括：每23 uL的反应体系包括10×ThermoPol Reaction Buffer（美国NEB公司）2.5 uL、2.5mM dNTPs 2 uL、1M 的Mg₂SO₄ 4 uL、8U/ uL Bst DNA酶（美国NEB公司） 1 uL、超纯水12.5 uL，以及如下的引物：

5 μM碱基序列如SEQ ID NO.1 和SEQ ID NO.2所示的引物各0.25 uL，50 μM碱基序列如SEQ ID NO.3 和SEQ ID NO.4所示的引物各0.25 uL。

本发明还涉及一种利用所述大肠杆菌O157:H7 LAMP检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：

（1）待检模板的制备：

粪便或者食物10克，加入到90mL磷酸盐缓冲液中，37℃震荡2h后，取1mL加入到9mL心脑浸出液培养基中；如果待检样品为液体，则直接取1mL加入到9mL心脑浸出液培养基中；培养基中再加入100 uL 浓度为50mg/mL新生霉素，37℃继续培养18h，吸取1mL培养物，500 r离心15min，弃沉淀，吸取上清至新离心管，12000r离心10min，弃上清，取沉淀重悬于1/10体积双蒸水中，沸水浴10min，4℃12000转离心10min，吸取上清，即待检模板DNA。

（2）取2 uL提取的待检模板加入到所述的反应液A中，终体积为25 uL，混匀，置于64℃恒温50 min进行LAMP扩增；

（3）结果判定：取出上述扩增反应管，在其中加入1 uL20×SYBR Green I，如反应管中液体变为绿色，则说明样品中含有大肠杆菌O157:H7；如果颜色为橘黄色，则说明样品中不含有大肠杆菌O157:H7。

有益效果  

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：