[发明专利]大肠杆菌O157:H7的LAMP检测引物及检测试剂盒

权利要求书

1.大肠杆菌O157:H7的LAMP检测引物，所述的引物碱基序列分别为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示：

SEQ ID NO.1：5-gtgtcgtactactgcatca-3                  

SEQ ID NO.2：5-gctggttttacctaaagactct-3                  

SEQ ID NO.3：5-tcccagtaaacacgacacttttactagatggtattaatgttggggag-3              

SEQ ID NO.4：5-atcttgtgatacgagcacggataatcgccattaccaaaaggc-3

所述的引物检测大肠杆菌O157:H7扩增产物为226bp。

2.含有权利要求1所述引物的检测大肠杆菌O157:H7的试剂盒，其特征是，试剂盒包括反应液A和SYBR Green I，所述反应液A具体包括：

每23 uL的反应体系包括10×ThermoPol Reaction Buffer2.5 uL、2.5mM dNTPs 2 uL、1M 的Mg₂SO₄ 4 uL、8U/ uL Bst DNA酶1 uL、超纯水12.5 uL，以及如下的引物：

5 μM碱基序列如SEQ ID NO.1 和SEQ ID NO.2所示的引物各0.25 uL；

50 μM碱基序列如SEQ ID NO.3 和SEQ ID NO.4所示的引物各0.25 uL。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其用于检测大肠杆菌O157:H7方法，包括以下步骤：

（1）待检模板的制备：粪便或者食物10克，加入到90mL磷酸盐缓冲液中，37℃震荡2h后，取1mL加入到9mL心脑浸出液培养基中；如果待检样品为液体，则直接取1mL加入到9mL心脑浸出液培养基中；培养基中再加入100 uL 浓度为50mg/mL新生霉素，37℃继续培养18h，吸取1mL培养物，500 r离心15min，弃沉淀，吸取上清至新离心管，12000r离心10min，弃上清，取沉淀重悬于1/10体积双蒸水中，沸水浴10min，4℃12000转离心10min，吸取上清，即待检模板DNA;

（2）取2 uL提取的待检模板加入到权利要求2所述的反应液A中，终体积为25 uL，混匀，置于64℃恒温50 min进行LAMP扩增；

（3）结果判定：取出上述扩增反应管，在其中加入1 uL20×SYBR Green I，在日光下观察，如反应管中液体变为绿色，则说明样品中含有大肠杆菌O157:H7；如果颜色为橘黄色，则说明样品中不含有大肠杆菌O157:H7。