[发明专利]用于叶酸过表达癌细胞快速检测的比色方法

权利要求书

1.一种用于叶酸过表达的癌细胞的快速检测方法，其特征是包括以下步骤：

（1）将金纳米颗粒与不同比例的K₂PtCl₆和H₂PdCl₄混合制备出Au@PtPd纳米材料；

（2）利用6-巯基-己醇和叠氮-11-烷基-硫醇对Au@PtPd纳米粒子表面修饰，通过点击化学技术与炔基化的叶酸进行偶合；

（3）叶酸受体靶向的叶酸/Au@PtPd纳米材料与癌细胞进行孵育，离心分离；

（4）取（3）悬浮液与显色剂混合，加入显色剂溶液底物；

（5）比较（4）得到溶液颜色，将其溶液滴在色谱纸亲水区（样品区）上，晾干，扫描仪扫描对其色度分析。

2.根据权利要求1在步骤（1）中， 所述Au@PtPd纳米材料制备方法，量取80mL去离子水于三口烧瓶中，加热至90℃，加入0.8mL 1%的HAuCl₄，加热至96℃并保持一分钟，之后加入2.8 mL 1%柠檬酸钠，继续搅拌15min，自然冷至室温，秤取0.048g K₂PtCl₆于50 mL水中，0.035 g PdCl₂溶于2 mL 0.2 mol/L的盐酸并加水稀释至100 mL，取5 mL金纳米溶液与40 μL 2mmol/L K₂PtCl₆和40 μL 2mmol/L  H₂PdCl₄溶液混合，加入10倍量的抗坏血酸，剧烈震荡，溶液颜色由棕色变为灰色。

3.根据权利要求1在步骤（2）中，所述的对Au@PtPd纳米材料表面进行叶酸功能化具体方法，6-巯基-己醇，叠氮-11-烷基-硫醇和Au@PtPd按照物质的量比为20:10:1混合，所得溶液在25℃下放置72小时，采用分子量30 kDa 的半透膜进行透析30min，Au@PtPd纳米材料表面形成6-巯基-己醇和叠氮-11-烷基-硫醇包覆物（A）；1.0 g 叶酸溶入 10 mL二甲基甲酰胺（DMF），待完全溶解后再加入0.26 g N-羟基琥珀酰亚胺和 0.44 g 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺（EDC），得到的混合物在冰浴中继续搅拌，直至得到白色沉淀，然后再向其中加入 0.124 g 炔丙胺的 DMF 溶液(5 mL)，得到的混合物在室温下搅拌 24 h，接着加入 100 mL蒸馏水，搅拌 40 min，产生沉淀，停止反应，过滤，得到桔黄色沉淀，用丙酮洗涤，真空干燥，得炔基化叶酸（B）；把A物质和B物质按照物质的量之比为1:10混合，加入CuSO₄和抗坏血酸的浓度分别为0.01 mol/L和0.05 mol/L，放置10h，得到叶酸受体靶向的叶酸/Au@PtPd材料。

4.根据权利要求1在步骤（3）中，所述叶酸受体靶向的叶酸/Au@PtPd材料与肿瘤细胞进行孵育，孵育时间30 min，在转速1000rpm离心5 min。

5.根据权利要求1在步骤（4）中，所述显色剂TMB溶液底物为H₂O₂，取1 mL（3）悬浮液与显色剂100 μL 0.1 mmol/L TMB和100 μL 0.1 mmol/L H₂O₂混合，加入pH 6.5的磷酸缓冲溶液1 mL，静置10 min，溶液颜色变蓝。

6.根据权利要求1在步骤（5）中，所述色谱纸亲水区，利用蜡打印技术在色谱纸纸上打印圆形图案，直径5 mm，将打印蜡的图案放在恒温150℃下2min，未打印蜡的地方为亲水区，在亲水区滴加50μL（4）得到的溶液，在室温下放置，晾干，扫描仪扫描对亲水区域色度进行分析，定量测定细胞数量。

7.根据权利要求1所述本发明所述显色剂为邻苯二胺（OPD），2,2'-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐（ABTS）和3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（TMB）。