[发明专利]一种抗ZEN卵黄抗体及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于免疫学技术领域，具体涉及一种抗ZEN（玉米赤霉烯酮）的卵黄抗体及其制备方法。

背景技术

ZEN（zearalenone，玉米赤霉烯酮）又称 F-2 毒素，为 2，4-二羟基苯甲酸内酯类化合物，具有很高的雌激素活性，主要是由侵染玉米、小麦、大麦、燕麦和高粱等作物的禾谷镰刀菌和黄色镰刀菌等产生的一种非甾类雌激素型真菌毒素，对人类和动物可产生多种毒副作用，例如，具有较强生殖毒性和致畸作用，可引起动物发生雌激素亢进症，导致动物不孕或流产，对猪、家禽和反刍动物影响较大，给畜牧业带来很大经济损失；此外，ZEN 还具有细胞毒性、免疫毒性、肝毒性和潜在致癌性等，严重威胁人类健康。由于 ZEN 在谷物中污染的普遍性和对人畜的高度危害，截止2004年，已有27个国家和地区对玉米赤霉烯酮在食品和饲料中的含量进行了限制，欧盟于2007 年制定了统一的限量标准，规定谷物和玉米中 ZEN的含量分别不能超过0.1mg/kg 和0.35mg/kg，我国规定人食用的小麦、面粉、玉米和玉米（渣）中ZEN 含量不能超过60μg/kg。因此，建立对ZEN快速、准确、简便的检测方法非常重要。

目前测定谷物、饲料等中ZEN 的方法主要有薄层层析法(thin-layer chromatography，TLC)、气相色谱法( gas chromatography，GC)、液相色谱法( liquid chromatography，LC)、高效液相色谱法（HPLC）等，这些检测方法有许多弊端，比如需要昂贵的仪器设备、大量的样品前处理、复杂的操作程序以及专业的操作人员。

近年来基于抗原、抗体反应技术建立的使用胶体金免疫层析技术（colloidal gold immunochromatographic assay，GICA）和酶联免疫吸附技术使得对ZEN的检测具有简便、快速、特异、灵敏、不需特殊设备和人员培训、结果判断直观等优点，因而特别适合于广大基层大批量检测及大面积普查。然而无论是GICA法还是酶联免疫吸附技术，其检测试剂盒的技术关键都需要人工制备针对ZEN的单克隆抗体，目前针对ZEN的单克隆抗体多为鼠源性，其制备复杂，产量低，生产分离成本高，因而很大程度限制了ZEN快速检测体系的建立。

卵黄免疫球蛋白(Immunoglobulin of egg yolk， IgY)，又称卵黄抗体，是母鸡血液中的免疫球蛋白传递至鸡卵黄并在子鸡孵育过程中和孵育后对子鸡起保护作用的免疫球蛋白，IgY的结构与IgG相似，具有典型的IgG空间构象，可与特异性抗原结合，很多方面优于哺乳动物的IgG，如IgY具有不与人类补体以及类风湿因子结合等免疫学特性。IgY的功能性试验、体外模拟试验以及临床应用证实，通过抗原免疫产蛋母鸡获得的特异性抗体IgY可用于制备生物诊断试剂和治疗制剂等，并且鸡卵黄抗体(IgY)具有以下优点：母鸡易于饲养，收集鸡蛋方便；无需抽动物血、无损伤，符合现代动物保护原则；而且具有产率高、成本低、稳定性好、特异性强等特点，因此在免疫诊断、疾病预防等方面具有广泛的应用前景。然而现有技术中，尚未见到有关抗ZEN卵黄抗体及其制备的有关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗ZEN卵黄抗体及其制备方法，从而可以加快ZEN快速检测反应体系的建立。

本发明采取的技术方案如下：

一种抗ZEN卵黄抗体，采用以下方法步骤制备：

（1）利用Thouvenot法和碳二亚胺法，人工合成ZEN-BSA（玉米赤霉烯酮-牛血清蛋白）抗原；

（2）将人工合成ZEN-BSA抗原对蛋鸡免疫接种，免疫3~5次后收集鸡蛋；具体包括以下步骤：

（2-1）将步骤（1）制备的ZEN-BSA抗原粉末溶于PBS（磷酸盐缓冲液，pH7.4）中，然后将溶解有ZEN-BSA的PBS与佐剂乳化制得免疫用ZEN-BSA抗原；

所述PBS的浓度为0.1mol/L；所述佐剂为弗氏佐剂；

所述ZEN-BSA抗原粉末溶于PBS时按1mgZEN-BSA溶于1mLPBS的比例制备；

所述溶解有ZEN-BSA的PBS与佐剂按1：1的体积比例制备；

（2-2）将步骤（2-1）制得的免疫用ZEN-BSA抗原免疫接种蛋鸡3~5次；

所述蛋鸡为21~23周龄健康产蛋母鸡；

所述免疫接种方法为皮下和肌肉多位点接种；

所述免疫接种4次，第一次免疫接种一至两周后免疫接种第2次，以后每隔7~12天免疫接种一次；