[发明专利]痕量RNA实时动态检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及检验技术领域，尤其涉及的是一种痕量RNA实时动态检测方法。

背景技术

核糖核酸RNA是存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体，对基因的表达与蛋白质生物合成起重要的作用。在生物体内主要有四种不同的RNA分子，分别是信使RNA（mRNA）、转移RNA（tRNA）、核糖体RNA（rRNA）、微小RNA（microRNA，miRNA）。它们参与各种各样的调节途径，包括发育、病毒防御、造血过程、器官形成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢等等。最近的研究发现，miRNA表达与多种癌症相关，这些miRNAs所起的作用类似于抑癌基因和癌基因的功能。要了解RNA在基因调控中扮演的角色，很关键的一个方法就是迅速、准确地定量检测RNA基因的表达。因此如果早期能对疾病进行分子水平RNA的检测，将为疾病的早期诊断提供重要的依据。

但是由于小分子RNA是一类很小的分子，部分小分子RNA表达水平极低，因而需要极为灵敏而定量的分析工具。传统常用的检测方法有Northern blot技术、RNA芯片技术和实时定量PCR技术三类。Northern blot技术是验证和确认RNA的重要方法,但该方法操作繁琐并且灵敏度低,不适用于临床样本的高通量检测芯片技术检测方法可以实现快速、高通量的检测，但其需要的RNA初始样本量大，并且以杂交为基础，因此无法区分单碱基差异的RNA，再者，芯片技术检测的结果为半定量，该方法的重现性和准确性较差,一般多用于初筛。实时定量PCR技术可以定量分析RNA的表达，且样本需要量较少，显著提高了敏感度，但对于miRNAs检测存在以下问题，由于成熟miRNAs长度较短，难以针对成熟miRNAs设计有效的特异性引物和探针，只能用前体miRNAs来代替，因此无法真实体现相应的成熟miRNAs水平。另外，实时定量PCR是基于体外扩增的技术，易受扩增温度的影响，后来演变出以滚环扩增（RCA）技术为代表的等温扩增技术，可以实现低丰度核酸的等温检测。然而该技术同样存在着如下缺陷，当前，RCA均相检测RNA多采用荧光染料与DNA产物相结合并产生强荧光进行检测，但由于荧光染料与溶液中的DNA和RNA都能结合，在实际样品分析时易使检测的背景值偏高，降低检测的灵敏度。并且，上述实时定量PCR技术、RCA技术都是是以扩增为基础，检测结果的特异性存在风险，极大的限制了核酸检测技术的应用。因此，实现无需荧光标记无需核酸扩增的低丰度核酸直接检测和实时动态监测将是方法学上的一大突破。

双链特异性核酸酶(Duplex-specificnuclease,DSN)能够选择性降解DNA-RNA杂交体中的DNA,对单链核酸分子几乎没有作用，因此是构建RNA文库中的最经典工具之一。近年来，有文献报道了将DSN用于miRNA检测，其原理也是基于DSN能够选择性降解DNA-RNA杂交体中的DNA。通过使体系中RNA与DNA探针杂交，再运用DSN酶切DNA-RNA双链中的DNA单链，使RNA单链游离后继续与预先包被的DNA探针进行杂交。重复上述“杂交-酶切-游离”过程即可实现检测信号的放大。然而上述方法有两个问题尚无法克服：1）miRNA检测技术是基于终点观测，无法动态观测miRNA-DNA结合与选择性酶切这一动态过程，因此检测结果的可靠性受到质疑。2）由于芯片上的包被的DNA数量是有限的（过高则存在较大空间位阻，过低则灵敏度差），从而使得上述miRNA检测的最低检出限差，无法真正实现临床样本中低浓度miRNA的无扩增直接检测。

表面等离子体共振（SPR）技术可以实时动态监测生物大分子间的反应，是观测生物分子结合与解离的可靠检测技术。本发明拟通过SPR技术平台构建能够实时动态监测痕量RNA的核酸检测技术。并且通过发明一维碳纳米材料石墨烯金膜包被技术和纳米金修饰探针技术，数量级放大已包被的DNA探针质量信号，结合DSN的循环酶切技术，从而指数级提高检测灵敏度，从而实现RNA的无需扩增直接检测与动态观测。最终建立一套“可视化”DSN信号放大RNA实时动态监测方法，以期为疾病的早期诊断提供可靠技术支撑（原理如图1所示）。为增强检测方法的灵敏度，引入了一种吸附性很强的石墨烯，通过构建的石墨烯芯片实现高效包被DNA探针，同时，对DNA探针进行纳米金修饰，增加探针的质量，从而增大SPR的监测信号。另外，石墨烯芯片上的石墨烯可以将纳米金与芯片上的金膜物理隔离，避免造成SPR信号干扰。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的灵敏度不足和无法实时动态观测的问题提供一种痕量RNA实时动态检测方法。

本发明的技术方案如下：