[发明专利]一种脱细胞胎盘基质材料的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种胎盘基质材料的制备方法，属于生物材料领域。

背景技术

胎盘是一种母体和胎儿物质交换的重要的器官，它富含细胞外基质和基底膜。胎盘基质中含有丰富的生长因子，如，表皮细胞生长因子（EGF）、成纤维细胞生长因子（bFGF）、转化生长因子（TGF）、血管内皮生长因子（VEGF）、肝细胞生长因子（HGF），可用于促进伤口愈合，辅助治疗皮肤癣、类风湿关节炎等疾病。

现代医学研究表明，胎盘具有抗感染、增强机体抵抗力、对血凝的影响等作用：胎盘γ-球蛋白含有麻疹、流感等抗体以及白喉抗毒素等，可用于预防或减轻麻疹等传染病。胎盘γ-球蛋白中还含干扰素，临床上可用于预防或控制病毒感染。胎盘中还含有溶菌酶，可防止小鼠（腹腔注射）由肠炎引起的死亡；对内毒素对大鼠的伤害也有一定的保护作用；给小鼠口服胎盘粉，能减轻结核病变，而在试管中反能促进结核杆菌的生长，故认为其作用主要在于增加机体抵抗力。脱脂后胎盘的盐酸水解产物，给大鼠腹腔注射，对四氯化碳及乙硫基丁氨酸引起的肝脂肪沉着，有明显的抑制作用。给小鼠皮下注射人胎盘提取物，可使其游泳时间延长；对大鼠肌肉注射，对某些实验类型（利血平性、紧张性、结扎幽门下部等）的实验性溃疡，也有一定的预防及治疗效果；胎盘中含有尿激酶抑制物，能抑制尿激酶对纤维蛋白溶酶元的活化作用；此可解释妊娠纤溶活性之降低。据测定，妊娠时子宫肌层中纤维蛋白溶酶元活化物与尿激酶抑制物的比例为1:3.4，而胎盘中二者之比例则高达1:1197。人胎盘中含有低分子量的凝血因子ⅩⅢ，因此可用来治疗因ⅩⅢ因子缺乏的出血患者。此种凝血因子不仅能稳定纤维蛋白凝块、促进创伤愈合，在动物实验中还有抗组织胺的作用；在离体试验中，胎盘提取物能促进受抑制心脏的恢复。胎盘蛋白中，含有肾素样的升压物质。人胎盘含有的糖蛋白成分，在体外试验中，能抑制淋巴细胞中DNA的合成，但不影响细胞的活力。胎盘提取物大量时能抑制去氧麻黄碱引起的发热。冷藏胎盘的胃蛋白酶消化液、水提取液及70%丙酮提取物用瓦氏呼吸器测知，能促进肝、心、脑等数种组织的呼吸及酵母菌的呼吸。胎盘血清对离体豚鼠子宫有兴奋作用，类似垂体后叶激素。

以上均为胎盘的药物学研究及应用，利用胎盘作为组织工程材料的研究及应用鲜有报道。胎盘组织中含有丰富的细胞外基质和保存完好的内源性生长因子。这种细胞外基质具有类似于正常皮肤组织细胞再生真皮的功能。提供了有利于细胞生长和分化，并有效调节全层皮肤伤口愈合的微环境。但是胎盘组织中具有多种免疫原性物质，直接用于机体会产生强烈的免疫反应，副作用强，因此需要采用脱细胞方法脱去其免疫原性物质。

Ji Suk Choi等，“Human extracellular matrix(ECM)powders for injectable cell delivery and adipose tissue engineering”，Journal of Controlled Release139(2009)2–7公开了一种制备脱细胞胎盘基质的方法，步骤如下：（1）将胎盘组织用纯化水反复清洗，除去血液成分。将胎盘组织与水按照2:1的比例混匀，室温匀浆5min，再离心分离（3000g，5min），弃去上清液，得到下层组织，之后反复离心清洗；（2）将（1）中得到的组织用0.5%的SDS（加液量与组织的体积比为1:1）于室温下振荡浸泡30min，浸泡完毕，用纯化水离心清洗4天直至除去残留的SDS；（3）将（2）中得到的组织与核酸酶（0.2%的DNA酶（酶活单位2000U）&200mg/ml的RNA酶）于37℃下混合浸泡10min，浸泡完毕，用纯化水用离心清洗2天；（4）将（3）中得到的组织与水按照一定比例混合均匀，导入模具中，于-70℃下冷冻干燥48h以上，最终得到脱细胞胎盘基质材料（片状，直径=15mm，厚度=10mm）。该方法可以制备得到核酸残留量低的脱细胞胎盘基质，核酸残留量仅为34.3±3.2ng/mg，但是，该方法需要同时采用SDS和核酸酶进行脱细胞，成本高，难以大规模工业应用。

需要寻找一种制备方法简单，成本低廉的制备方法。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种制备脱细胞胎盘基质材料的制备方法及该方法制得的基质。

本发明脱细胞胎盘基质材料的制备方法，包括如下步骤：

（1）取新鲜胎盘组织，清洗，加水，匀浆，离心，弃上清，得下层组织；

（2）取步骤（1）得到的下层组织，在甲醇和三氯甲烷的混合溶液浸泡2～6h，离心，弃上清，清洗，得下层组织；所述混合溶液中，甲醇和三氯甲烷的体积比为（0.5～1.5）:（0.5～1.5）；