[发明专利]从猪血中分离纯化纤维连接蛋白的生产工艺

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物制剂的提取工艺，特别涉及一种利用离心、盐析、透析及亲和层析相结合的方法从猪血中分离纯化纤维连接蛋白的生产工艺。

背景技术

纤维连接蛋白是广泛存在于各种动物细胞表面、细胞外液、结缔组织及大多数基底膜的高分子糖蛋白，它具有多种生物学活性，例如参与细胞粘附、分化、迁移、增殖等，在维持血管完整性和通透性、伤口愈合、肿瘤发生和转移、血液凝集及生殖发育中有重要作用。根据其在体内分布，分为血浆型与细胞型2种。血浆型主要存在于血浆及体液中，又称可溶性纤维连接蛋白，其含量对多种疾病的诊断和预后有重要意义。目前，国内外学者对纤维连接蛋白的基础研究和疾病检测，乃至临床治疗都进行了大量的报道。

动物血中含有丰富的纤维连接蛋白等生物活性物质，采用明胶亲和层析法可以对鸡血、牛血中纤维连接蛋白的进行提取。目前，我国生猪出栏量日渐增高，但是屠宰后产生的大量猪血液资源利用率较低，主要用作饲料添加剂或食用的血豆腐等低值产品，这不仅造成蛋白质资源的浪费，而且造成严重的环境污染。

发明内容

本发明的目的提供一种利用离心、盐析、透析及亲和层析相结合的方法从猪血中分离纯化纤维连接蛋白的生产工艺方法。

如上构思，本发明的技术方案是：一种从猪血中分离纯化纤维连接蛋白的生产工艺，其特征在于：包括如下步骤：

①从全血中分离出血浆和血细胞；

②盐析：向上层血浆中加入酸性Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液并充分混匀，然后边搅拌边加入硫酸铵，使其饱和度达到20%，并调节pH至碱性，然后放入冰箱冷藏1.5-2.5h使之充分沉淀，最后再经离心所得沉淀主要成分即为纤维连接蛋白；

③透析除盐：将②步沉淀溶于酸性PBS缓冲液中,装入透析袋内进行透析,每8-10h换一次透析液,直至用10%BaCl₂检测无SO₄^2-为止，收集透析袋内液体进行浓缩操作，即得纤维连接蛋白粗品；

④纯化：先用Tris-HCl缓冲液作为平衡液、碱性TB缓冲液作为洗脱液,将③步所得纤维连接蛋白粗品上样于明胶Sepharose-4B柱进行亲和层析，用TB缓冲液将不吸附部分洗脱，然后用6mol/L尿素洗脱纤维连接蛋白，收集洗脱液，合并洗脱液，用TB缓冲液进行透析除去尿素，透析后浓缩即得纤维连接蛋白纯品。

上述步骤②Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液的pH=6.3，并且Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液的加入量与上层血浆等体积。

上述步骤②中Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液的浓度为0.0175mol/L。

上述步骤②中离心的速度为3000r/min，时间为15min。

上述步骤③中PBS缓冲液的pH=6.3。

上述步骤④中TB缓冲液的浓度为0.05mol/L，pH=7.5；Tris-HCl缓冲液中含5mmol/L苯脒。

本发明将血液分离后获得的血浆液经过盐析沉淀和透析除盐过程后得到纤维连接蛋白粗品，再经过明胶柱亲和层析后，经由特定容积洗脱得到纯化后的纤维连接蛋白纯品，因此本发明工艺简单，所需设备要求较低，适合工业化生产。不仅可以满足纤维连接蛋白等生物活性物质规模化生产的需要,而且能够提高动物血资源综合利用率和提高产品附加值。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明：

一种从猪血中分离纯化纤维连接蛋白的生产工艺，包括如下步骤：

1、血浆和血细胞的分离：取500mL添加有6‰柠檬酸钠抗凝剂的全血，经3000r/min离心20min，分离血浆和血细胞。

2、盐析：向上层血浆中加入等体积的0.0175mol/LNa₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液(pH6.3)并充分混匀，然后边搅拌边加入280g硫酸铵，使其饱和度达到20%，用5%NaOH调节pH至7.0,放入4℃冰箱2h使之充分沉淀。再经3000r/min离心15min,所得沉淀主要成分即为纤维连接蛋白。