[发明专利]一种检测烟草花叶病毒的胶体金免疫层析试纸及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于农业技术领域，具体涉及一种检测烟草中烟草花叶病毒的胶体金免疫层析试纸及其制备方法。

背景技术

烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）是一类分布广泛，并能够感染多种植物的有害病毒，此病毒最早于1857年就曾被Swieten在烟草生长的反常现象中发现，并记载了感染此病毒的植物的病理特征。1886年Mayer首次将此病毒命名为“Mosaic”，并且通过一系列实验证明了此病毒具有传染性。直到1939年，德国的科学家Kausche等利用电子显微镜技术第一次观察到了烟草花叶病毒（TMV）的杆状病毒颗粒。

烟草花叶病毒引起的植物病害在全世界烟叶种植地区均有发生，我国的南北烟叶种植区广泛的存在此病害，尤以南方烟叶种植地区发病率为高。目前对于烟草病毒的诊断主要通过ELISA（酶联免疫吸附检验技术）检测和应用电子显微镜检测；ELISA是目前较为广泛的方法，然而该方法必须要使用抗血清，商业渠道购买的抗血清价格昂贵且品种较少，无法满足烟草生产上多种病毒病诊断的需要，自制抗血清程序复杂，产生的抗血清质量往往不高，不宜用于准确的诊断，同时对那些在植物体内含量较低的病毒，该检测方法往往灵敏度不够，无法实现可靠的诊断。

由于传统病毒诊断方法往往需要较长的时间，并且每次诊断只能针对单一的病原物，面对病毒复合浸染的情况往往显得束手无策，有时甚至会得出错误的结论，从而导致生产上大面积防治措施不能及时到位。因此急需研究一种灵敏度高、测试准确、稳定性强的烟草花叶病毒诊断试纸。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种灵敏度高、稳定性强、测定准确，可应用于烟草花叶病毒检测的胶体金免疫层析试纸。

本发明的第一目的是这样实现的，该试纸包括样品垫、含有烟草花叶病毒标记抗体的胶体金结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和背板，所述样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫从上到下依次固定在背板上，裁切为0.4cm×5cm的条，与干燥剂一起放入铝箔袋密封包装，4℃贮存；所述硝酸纤维素膜上设置有相互分离的检测区和质控区，所述检测区含有烟草花叶病毒包被抗体，所述质控区含有能与所述烟草花叶病毒标记抗体特异结合的抗抗体。

所述烟草花叶病毒标记抗体为烟草花叶病毒抗体和胶体金粒子结合形成的聚合体。

所述烟草花叶病毒标记抗体为烟草花叶病毒单克隆抗体。

所述烟草花叶病毒包被抗体为烟草花叶病毒单克隆抗体；所述抗抗体为羊抗鼠IgG抗体。

本发明的第二目的在于提供一种制备上述检测烟草花叶病毒的胶体金免疫层析试纸的方法。

本发明的第二目的是这样实现的，包括以下步骤：

A、制备烟草花叶病毒标记抗体：

1）配制1%的氯金酸溶液：称取1g氯金酸用90ml去离子水溶解，容量瓶定容到100ml，然后用0.22um滤膜过滤，4℃避光保存；

2）配制1%的柠檬酸三钠溶液：称取1g柠檬酸三钠用90ml去离子水溶解，容量瓶定容到100ml，然后用0.22um滤膜过滤；

3）配制0.1M的碳酸钾溶液：称取1.38g碳酸钾用90ml去离子水溶解，容量瓶定容到100ml，然后用0.22um滤膜过滤；

4）采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金：用量筒量取495ml去离子水，倒入玻璃两颈瓶中，准确加入5ml 1%的氯金酸溶液；在玻璃两颈瓶中放入一个磁力搅拌子，链接球形冷凝管，用可控温电磁加热搅拌器加热至沸腾；在搅动下准确加入１％的柠檬酸三钠溶液 5ml，金黄色的氯金酸溶液在２分钟内变为紫红色，继续煮沸５分钟，冷却后以去离子水恢复到原体积；

 5）用胶体金标记烟草花叶病毒抗体：用0.1M的碳酸钾溶液将胶体金的PH值调至7.5，然后按照12微克抗体每毫升胶体金的量加入烟草花叶病毒抗体，室温搅拌反应1小时，再加入浓度为1%的 BSA反应1小时；反应完毕后，用离心机以12000rpm的转速在4℃的温度下离心20分钟，弃去上清，将红色沉淀物重悬后即得到用胶体金标记的烟草花叶病毒标记抗体，4℃保存；

B、制备设置有检测区和质控区的硝酸纤维素膜：

将所述烟草花叶病毒包被抗体和抗抗体分别喷在硝酸纤维素膜的两端不同区域，形成检测区和质控区，得到含有检测区和质控区的硝酸纤维素膜，然后放入干燥室中干燥；

C、制备含有烟草花叶病毒标记抗体的胶体金结合垫：