[发明专利]一种检测烟草花叶病毒的胶体金免疫层析试纸及其制备方法

权利要求书

1.一种检测烟草花叶病毒的胶体金免疫层析试纸，该试纸包括样品垫、含有烟草花叶病毒标记抗体的胶体金结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和背板，所述样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫从上到下依次固定在背板上；其特征在于，所述硝酸纤维素膜上设置有相互分离的检测区和质控区，所述检测区含有烟草花叶病毒包被抗体，所述质控区含有能与所述烟草花叶病毒标记抗体特异结合的抗抗体。

2.根据权利要求1所述的检测烟草花叶病毒的胶体金免疫层析试纸，其特征在于，所述烟草花叶病毒标记抗体为烟草花叶病毒抗体和胶体金粒子结合形成的聚合体。

3.根据权利要求2所述的检测烟草花叶病毒的胶体金免疫层析试纸，其特征在于，所述烟草花叶病毒标记抗体为烟草花叶病毒单克隆抗体。

4.根据权利要求1所述的检测烟草花叶病毒的胶体金免疫层析试纸，其特征在于，所述烟草花叶病毒包被抗体为烟草花叶病毒单克隆抗体；所述抗抗体为羊抗鼠IgG抗体。

5.根据权利要求4所述的检测烟草花叶病毒的胶体金免疫层析试纸，其特征在于，所述烟草花叶病毒包被抗体的浓度为2 mg /ml，所述羊抗鼠IgG抗体的浓度为1 mg /ml。

6.根据权利要求1所述的检测烟草花叶病毒的胶体金免疫层析试纸，其特征在于，所述样品垫和胶体金结合垫均采用玻璃纤维膜制作。

7.一种制备如权利要求1至6中任一权利要求所述的检测烟草花叶病毒的胶体金免疫层析试纸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、制备烟草花叶病毒标记抗体：

1）配制1%的氯金酸溶液：称取1g氯金酸用90ml去离子水溶解，容量瓶定容到100ml，然后用0.22um滤膜过滤，4℃避光保存；

2）配制1%的柠檬酸三钠溶液：称取1g柠檬酸三钠用90ml去离子水溶解，容量瓶定容到100ml，然后用0.22um滤膜过滤；

3）配制0.1M的碳酸钾溶液：称取1.38g碳酸钾用90ml去离子水溶解，容量瓶定容到100ml，然后用0.22um滤膜过滤；

4）采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金：用量筒量取495ml去离子水，倒入玻璃两颈瓶中，准确加入5ml 1%的氯金酸溶液；在玻璃两颈瓶中放入一个磁力搅拌子，链接球形冷凝管，用可控温电磁加热搅拌器加热至沸腾；在搅动下准确加入１％的柠檬酸三钠溶液 5ml，金黄色的氯金酸溶液在２分钟内变为紫红色，继续煮沸５分钟，冷却后以去离子水恢复到原体积，得到胶体金； 

5）用胶体金标记烟草花叶病毒抗体：用0.1M的碳酸钾溶液将胶体金的PH值调至7.5，然后按照12微克抗体每毫升胶体金的量加入烟草花叶病毒抗体，室温搅拌反应1小时，再加入浓度为1%的 BSA反应1小时；反应完毕后，用离心机以12000rpm的转速在4℃的温度下离心20分钟，弃去上清，将红色沉淀物重悬后即得到用胶体金标记的烟草花叶病毒标记抗体，4℃保存；

B、制备设置有检测区和质控区的硝酸纤维素膜：

将所述烟草花叶病毒包被抗体和抗抗体分别喷在硝酸纤维素膜的两端不同区域，形成检测区和质控区，得到含有检测区和质控区的硝酸纤维素膜，然后放入干燥室中干燥；

C、制备含有烟草花叶病毒标记抗体的胶体金结合垫：

将所述烟草花叶病毒标记抗体用缓冲液稀释,得到浓度为OD1.5的烟草花叶病毒标记抗体溶液，用上述烟草花叶病毒标记抗体溶液浸泡玻璃纤维膜，或是直接喷涂到玻璃纤维膜上，得到胶体金结合垫，然后放入干燥室中干燥；

D、制备样品垫：将玻璃纤维膜在温度为37℃的缓冲液中浸泡1小时，得到样品垫，然后放入干燥室中干燥；

E、将所述样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫从上到下依次固定在背板上，裁切得到检测烟草花叶病毒的胶体金免疫层析试纸，然后将试纸与干燥剂一起放入铝箔袋密封包装，4℃贮存。

8.根据权利要求7所述的制备检测烟草花叶病毒的胶体金免疫层析试纸的方法，其特征在于，所述步骤C和步骤D中的缓冲液由2ml TritonX100、10g BSA、50g蔗糖和950ml浓度为0.02M、pH为7.4的PBS缓冲液混合得到，调节PH至7.4，并定容到1000ml。

9.根据权利要求7所述的制备检测烟草花叶病毒的胶体金免疫层析试纸的方法，其特征在于，采用BioDot的XYZ3050喷膜系统中的BioJet喷头分别进行硝酸纤维素膜上检测区的喷涂和质控区的喷涂。