[发明专利]一种肿瘤细胞原代培养的方法

说明书

技术领域

本发明涉及细胞生物学领域，尤其涉及的是一种肿瘤细胞原代培养的方法。

背景技术

原代培养（primaryculture）也叫初代培养，指直接从体内取出的肿瘤细胞或组织进行的第一次的培养物。最常用的原代培养有组织块培养和分散细胞培养。组织块培养是将剪碎的组织块直接移植在培养瓶壁上，加入培养基后进行培养。分散细胞培养则是将组织块用机械法或化学法使细胞分散。如欲从临床活检或切除的肿瘤组织分离到活性最好的游离细胞，经典的方法是用蛋白水解酶（如胰蛋白酶和胶原酶）消化细胞间的结合物，或用金属离子螯合剂（如EDTA）除去细胞互相粘着所依赖的Ca²⁺，再经机械轻度振荡，使之成为单细胞。

现有技术的缺点是：（1）恶性肿瘤组织类型复杂，体外原代培养成功率不能保证为100%。（2）通过酶消化法分离的肿瘤细胞，体外增殖后再进行试验，操作复杂，最关键是体外扩增本身具有细胞选择作用，得到的细胞能否代表体内真实细胞组成。（3）非肿瘤组织和坏死组织难以较好的去除，可明显影响体外原代培养成功率。（4）对细胞量要求较高，量过多或过少都不利于原代培养的成功。（5）现有方法容易受到培养体系的影响，特别是小牛血清的质量和数量，培养基种类，肿瘤细胞类型和污染等都是影响肿瘤细胞体外原代培养的主要因素。

因此，现有技术存在缺陷，需要改进。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术在肿瘤细胞原代培养中存在的问题，提供了一种肿瘤细胞原代培养的方法。

本发明的技术方案如下：

一种肿瘤细胞原代培养的方法，其特征是，其步骤如下：

（1）肿瘤样本在实体瘤患者手术切除后的半小时内进行收集，收集方法为，在无菌环境下，切取非坏死部位的肿瘤样本，其体积在1cm³以上，将其置于盛有提前在4℃冰箱中预冷的20mL RPMI1640培养液（对不同类型的肿瘤细胞，培养液类型可能不同）的50mL塑料无菌带盖离心管内，离心管置冰上运输，迅速带回实验室；其中RPMI1640培养液中含10%Hyclone肽牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素；

（2）在生物安全柜内，将肿瘤样本转移至100mm细胞培养皿（Corning，430167）内，用1×PBS10mL冲洗三次，将血细胞清洗掉，然后剔除肿瘤样本表面筋膜等非肿瘤组织；

（3）将步骤（2）中处理后的肿瘤组织转移至一新的100mm培养皿内，滴加0.5mL PBS，用无菌手术刀片，手术剪和手术镊将肿瘤组织分割为直径小于1mm的小碎块；

（4）将步骤（3）中切碎的肿瘤组织转移至50mL离心管，用台式离心机，500转/分钟，离心2分钟；然后用移液器小心移除离心管内上清，再用10mL含胶原酶II（200U/mL或5mg/mL）（对不同类型的肿瘤细胞，所用消化酶类型可能不同；或者采用0.25%胰酶溶液，37℃下消化时间10分钟）的无血清RPMI1640培养基进行重悬，置37℃恒温摇床上进行振荡消化，时间为1小时（消化时间取决于样本大小；如果样本大于1g则消化时间增至1.5-2小时）；之后用台式离心机500转/分钟，离心5分钟，弃去上清液，消化的肿瘤组织用10mL1×PBS重悬，研磨过筛，其细胞筛为100目，孔径0.16mm，将过筛的肿瘤细胞悬液收集于100mm培养皿中；

（5）将步骤（4）中收集的肿瘤细胞悬液过40μm孔径的细胞筛并收集于50mL离心管内，用血细胞计数板计数；然后将其在1200转/分，离心5分钟，弃去上清，再用无血清RPMI1640培养基（对不同类型的肿瘤细胞，培养基类型可能不同）重悬，使其肿瘤细胞悬液的密度为1×10³细胞/mL；其中无血清RPMI1640培养基含有10ng/mL碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、20ng/mL表皮生长因子（epithelial growth factor，EGF）、5μg/mL胰岛素（insulin）和0.4g/100mL的牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）（对于不同组织类型的肿瘤，除了通用的bFGF和EGF外，其他需要添加的生长因子会有所不同；培养基要现配现用）；