[发明专利]一种肿瘤细胞原代培养的方法

权利要求书

1.一种肿瘤细胞原代培养的方法，其特征是，其步骤如下：

（1）肿瘤样本在实体瘤患者手术切除后的半小时内进行收集，收集方法为，在无菌环境下，切取非坏死部位的肿瘤样本，其体积在1cm³以上，将其置于盛有提前在4℃冰箱中预冷的20mLRPMI1640培养液的50mL塑料无菌带盖离心管内，离心管置冰上运输，迅速带回实验室；其中RPMI1640培养液中含10%Hyclone肽牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素；

（2）在生物安全柜内，将肿瘤样本转移至100mm细胞培养皿内，用1×PBS10mL冲洗三次，将血细胞清洗掉，然后剔除肿瘤样本表面筋膜等非肿瘤组织；

（3）将步骤（2）中处理后的肿瘤组织转移至一新的100mm培养皿内，滴加0.5mL PBS，用无菌手术刀片，手术剪和手术镊将肿瘤组织分割为直径小于1mm的小碎块；

（4）将步骤（3）中切碎的肿瘤组织转移至50mL离心管，用台式离心机，500转/分钟，离心2分钟；然后用移液器小心移除离心管内上清，再用10mL含200U/mL或5mg/mL胶原酶II的无血清1640培养基进行重悬，置37℃恒温摇床上进行振荡消化，时间为1小时；之后用台式离心机500转/分钟，离心5分钟，弃去上清液，消化的肿瘤组织用10mL1×PBS重悬，研磨过筛，其细胞筛为100目，孔径0.16mm，将过筛的肿瘤细胞悬液收集于100mm培养皿中；

（5）将步骤（4）中收集的肿瘤细胞悬液过40μm孔径的细胞筛并收集于50mL离心管内，用血细胞计数板计数；然后将其在1200转/分，离心5分钟，弃去上清，再用无血清RPMI1640培养基重悬，使其肿瘤细胞悬液的密度为1×10³细胞/mL；该无血清RPMI1640培养基包含有10ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、20ng/mL表皮生长因子、5μg/mL胰岛素和0.4g/100mL的牛血清白蛋白；

（6）将步骤（5）中1×10³细胞/mL的肿瘤细胞悬液置入超低粘附细胞培养6孔板中，每孔2mL，置于37℃，5%CO₂细胞培养箱中培养14天，期间每3天添加（5）所述无血清RPMI1640培养基100μL/孔；该培养基于4℃下保存不超过2周；

（7）培养后，当无血清培养基中形成的瘤球最大直径达200μm时，利用重力作用沉降10分钟，弃去上清，收集瘤球置于15mL离心管中；

（8）在步骤（7）中收集的瘤球细胞中加入1-5mLAccutase酶进行消化裂解，室温下10分钟；然后用移液器吹打消化液，1200转/分离心5分钟后弃去上清液；

（9）用含10%v/vHyclone肽牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的常规RPMI1640培养液5mL重悬步骤（8）中处理后的细胞，其密度≤10⁵细胞/mL，置入T25细胞培养瓶中进行贴壁扩大培养，待细胞铺满85%瓶壁时，进行细胞常规传代培养，细胞培养代数超过50代而没有衰老迹象，说明细胞原代培养和建系成功。