[发明专利]SCO6974基因缺失天蓝色链霉菌及其在提高抗生素产量的应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及SCO6974基因缺失天蓝色链霉菌及其在提高抗生素产量的应用。

背景技术

链霉菌（Streptomyces）是一种极具应用价值的微生物。据目前所知，约三分之二用于医药的天然抗生素以及共9000余种具生物活性物质都由链霉菌产生，它们在抗肿瘤、抗真菌、抗寄生虫、免疫抑制等方面具有重要作用。天蓝色链霉菌作为链霉菌研究的模式菌株，其研究价值及应用价值极高。作为抗生素代谢调控研究的模式菌株，对天蓝色链霉菌的研究较为深入，它能产生放线紫红素（ACT）、十一烷基灵菌红素（RED）、钙依赖抗生素（CDA）、次甲霉素（Mmy）。ACT属于聚酮中的苯并异色烷醌（benzoisochromanequinone,BIQ)类的抗生素，具有抗菌活性，在不同pH条件下培养，ACT会显现出不同的颜色，有助于研究和直接观察天蓝色链霉菌次级代谢过程的多效调控。CDA是一种脂肽类的抗生素，具有抗菌活性。

ACT化学结构式如下式1所示：

式1；

CDA的化学结构式如式2所示：

式2。

发明内容

本发明的目的是提供SCO6974基因缺失天蓝色链霉菌及其在提高抗生素产量的应用。

本发明提供了构建重组菌的方法，包括如下步骤：敲除天蓝色链霉菌基因组中的SCO6974基因，得到重组菌；

所述SCO6974基因的核苷酸序列为序列表中的序列1。

上述方法中，所述敲除天蓝色链霉菌基因组中的SCO6974基因通过同源重组的方法实现。

上述方法中，所述同源重组的方法包括如下步骤：

1）将含有预敲除SCO6974基因的片段导入含有SCO6974基因cosmid的出发菌中，得到中间菌，提取所述中间菌的质粒，得到SCO6974基因缺失的cosmid；

2）将SCO6974基因缺失的cosmid接合转移到天蓝色链霉菌中，得到SCO6974基因缺失的重组菌。

上述方法中，所述出发菌按照包括如下步骤的方法制备：将含有SCO6974基因的cosmid导入大肠杆菌E.coli BW25113/pIJ790中，得到出发菌；

所述SCO6974基因缺失的cosmid通过E.coli ET12567(pUZ8002)接合转移到天蓝色链霉菌中。

上述方法中，所述含有预敲除SCO6974基因的片段的核苷酸序列为序列表中的序列3；

所述天蓝色链霉菌为天蓝色链霉菌M145。

由上述方法制备的重组菌也是本发明保护的范围。

失活SCO6974基因的物质或上述的重组菌在提高抗生素产量中的应用也是本发明保护的范围。

上述应用中，所述失活SCO6974基因的物质为含有预敲除SCO6974基因的片段，所述片段的核苷酸序列为序列表中的序列3；

所述抗生素具体为放线紫红素和/或钙依赖抗生素。

SCO6974基因在调控抗生素产量中的应用也是本发明保护的范围；所述SCO6974基因的核苷酸序列为序列表中的序列1；所述抗生素具体为放线紫红素和/或钙依赖抗生素。

上述调控抗生素产量为提高抗生素产量。

本发明还提供了一种DNA片段，其核苷酸序列为序列表中的序列3。

本发明的实验证明，本发明利用PCR-Targeting技术构建了SCO6974基因敲除工程菌株，检测其与抗生素产生关系，结果为与未敲除的野生型菌株相比，SCO6974基因敲除工程菌株产生放线紫红素（ACT）和钙依赖抗生素（CDA）的量大。说明该基因与抗生素产生有关。

附图说明

图1为SCO6974基因敲除工程菌构建简图及PCR验证图

图2为SCO6974基因敲除工程菌放线紫红素（ACT）产量提高效果图

图3为SCO6974基因敲除工程菌钙依赖抗生素（CDA）产量提高效果图

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中培养基配方如下：

LB培养基配方：

细菌培养用胰化蛋白胨(bacto-tryptone)       10g