[发明专利]志贺氏菌荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明提供了一种志贺氏菌荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法，属于生物科学领域。 

背景技术

实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR)技术，于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术实现了PCR从定性到定量的飞跃，它以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快等优点成为了分子生物学研究中的重要工具，目前已得到广泛应用。由于实时荧光定量PCR是实时定量检测致病病原体基因核酸，因此它比化学发光、时间分辨、蛋白芯片等免疫学方法更具独到的优势。 

发明内容

一种志贺氏菌荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法，包含标准阳性模板、阳性对照品、阴性对照品、TaqDNA聚合酶和UNG酶混合液、荧光聚合酶链式反应液，其目的在于克服了现有技术的不足。 

本发明通过以下技术方案实现上述目的： 

根据志贺氏菌保守序列设计特异的引物和探针，当样品中含有志贺氏菌时，前增菌后提取的志贺氏菌DNA通过PCR成指数扩增，在反应过程中志贺氏菌特异的荧光探针跟靶核酸杂交，同时被Taq酶水解，把探针上的荧光基团和淬灭基团分开，从而通过荧光增量来实时判断志贺氏菌的存在。 

1、根据志贺氏菌管家基因设计引物和探针。 

引物： 

F Sequence(5’-3’)：GTTCCTTGACCGCCTTTCCGAT Tm55.02 

R Sequence(5’-3’)：AAGCTCCGCAGAGGCACTGAGT Tm55.75 

探针：CTGCACGCAATACCTCCGGATTCC 

Modification：5’6-FAM，3’BHQ1 

2、志贺氏菌增菌液DNA的制备(水煮法)。 

a将志贺氏菌于肉汤营养培养基平板上划线分离，置于37℃恒温培养箱中培养24小时； 

b挑取单菌落于营养肉汤液体培养基中，37℃震荡培养8小时； 

c加入终浓度为0.5％的甲醛溶液置于37℃恒温培养箱中灭活24小时。 

d将灭活的菌液置于离心机中10000r/min离心2min，弃上清，用双蒸水洗两次，加入适量双蒸水摇匀； 

e置于金属浴中煮沸备用。 

3、核酸扩增。 

具体实施方式：

以下通过实例更详细地对本发明的技术要点进行解释，为更好地理解本发明提供依据。 

1、灵敏度：检测的最高稀释度可达10-8～10-7，定量检测线性范围可达10-1010拷贝/ml。 

2、特异性：采用最新基因序列数据库设计，并通过系统验证，本试剂盒能够检测所有己知志贺氏菌毒株。对于其它菌株，本试剂盒检测结果为阴性。 

3、具体实施方式 

下面结合具体实例对本技术发明做进一步说明。 

实施例1 

检测试剂盒的性能评估 

检测方法灵敏度评估 

通过对市面上购买来的40份食品样品采用细胞培养、常规PCR、荧光定量PCR3种方法检测同时进行比较验证，结果荧光定量PCR法对LM的检出率为1215％，高于常规PCR的1010％和细菌培养分离的510％。如采用传统的细菌培养法进行细菌分离，虽然是一种经典方法，但全过程至少需要4～7d，通常检出限为1000cfu/ml，而采用本方法，检出限为10cfu/ml。 

实施例2 

临床样品中志贺氏菌的荧光定量PCR检测： 

检测样本类型： 

肛拭子、粪便等。 

适用仪器： 

ABI系列荧光定量PCR仪、Roche系列荧光定量PCR仪、Qiagen Rotor Gene等荧光定量PCR仪 。