[发明专利]志贺氏菌荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一种志贺氏菌荧光定量PCR检测试剂盒，包括DNA提取液、PCR反应液、Taq酶和UNG酶混合液、沙门氏菌阳性对照、阴性对照。其特征在于，PCR反应液中所含志贺氏菌特异性引物序列和探针，所述引物与探针如下： 

上游引物序列：Sequence(5’-3’)：GTTCCTTGACCGCCTTTCCGAT 

下游引物序列：RSequence(5’-3’)：AAGCTCCGCAGAGGCACTGAGT 

探针：CTGCACGCAATACCTCCGGATTCC Modification：5’6-FAM，3’BHQl 。

2.根据权利要求1所述的一种志贺氏菌荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，试剂盒PCR反应液中所含10×Buffer2.5μL/反应，Mg离子浓度为800μM，dNTP浓度为400μM，上下游引物浓度为0.2μM，探针浓度为0.3μM，Taq酶和UNG酶混合液中Taq酶浓度为50U/μL，UNG酶浓度为2U/μL。 

3.根据权利要求1所述的一种志贺氏菌荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于包含以下步骤： 

a取增菌液1ml加到1.5ml无菌离心管中，10,000rpm离心5min，弃去上清；加入50ul DNA提取液，充分混匀后沸水浴5min，13,000rpm离心5min，取上清液进行检测或保存于-20℃以待检测。 

b将PCR反应液置室温平衡，融化后取Taq酶和UNG酶混合液，按1μL/管加入酶混合液，即每个测试反应体系配制为：PCR反应液20ul+1ulTaq酶。 

c加入模板：将保存在-20℃的核酸提取物置室温解冻，以13,000rpm离心5min。阴、阳性对照使用前置室温解冻。在每个PCR反应管中分别加入步骤1中处理过的模板或阴、阳性对照各4uL，盖好管盖，置于PCR仪上，记录相应样品号。 

d上机扩增、检测区：反应条件为50℃：2min，1个循环；95℃：3min，1个循环；95℃：5sec，55℃：60sec(信号采集)，40个循环。反应体系设 为25ul。 

e检测样本Ct值≤35.0时，报告阳性。 

检测样本Ct值＞35.0且Ct值＜40时，需重复检测一次，如果Ct值仍＜40，但曲线有明显的对数增长特性，报告本阳性，否则报告阴性。样本不显示Ct值时，报告阴性。 

4.如权利要求书1所述的检测方法，其特征在于其反应体系为： 

组分       终浓度 

上游引物：0.16μM 

下游引物：0.16μM 

探针：0.24μM 

dNTP：320μM 

dUTP：320μM 

Mg：640μM 

10×Buffer：1× 

Taq酶：5U/反应 

UNG酶：0.2U/反应 

模板：4uL 

水：补至25uL 。