[发明专利]长效化PEG-rExendin-4改构体偶联物的制备

说明书

本发明公开了基因重组Exendin‑4改构体与Y型马来酰亚胺(Y‑MAL‑40K)聚乙二醇偶联而成的偶联产物制备工艺，相比未经PEG偶联修饰的rExendin‑4，在人体内血浆半衰期明显延长，偶联物较好保留了rExendin‑4生物学活性，达到减少用药次数，降低免疫原性作用，可以开发成治疗II型糖尿病的长效药物制剂。

技术领域

本发明涉及一种长效化的II型糖尿病治疗药物，应用基因重组Exendin-4改构体与特定Y型聚乙二醇衍生物偶联的新型制备工艺，生物学活性稳定，体内代谢时间明显延长。属于基因工程多肽药物制备和长效蛋白药物开发技术领域。

技术背景

GLP-1能在人体内血糖浓度增高时，刺激胰岛β细胞分泌胰岛素降低血糖，不会引起低血糖和体重增加，能保护患者的β细胞和修复受损的β细胞，延缓疾病进程。天然的GLP-1在体内会被DPP-IV迅速降解，其半衰期只有1-2分钟，限制了其本身作为药物开发的价值。近年来GLP-1类似物作为II型糖尿病的治疗药物倍受青睐，由美国Amylin和Elililly公司共同开发的Exenatide(商品名Byetta)已于2005年在美国上市，2011年在中国上市。Exendin-4是从希拉毒蜥(Heloderma suspectum)唾液中分离得到的含有39个氨基酸序列的GLP-1类似物，与天然的GLP-1有53％的结构同源性，能够与GLP-1受体结合。通过与GLP-1受体结合发挥促胰岛素分泌的作用，有效降低空腹和餐后血糖的作用，用于治疗II型糖尿病。并且Exendin-4对DPP-IV具有很好的耐受性，在体内半衰期约2小时，患者需要每日注射给药2次，患者使用不便，因此开发长效剂型或者非注射途径给药的制剂是该类药物发展的趋势。

聚合物修饰技术是上世纪70年代发展起来的一种常用修饰技术，其中尤以聚乙二醇化技术为代表。该技术是将聚乙二醇(PEG)与蛋白药物化学结合，形成PEG与蛋白质或多肽的偶联物，制备长效蛋白质和多肽药物的制剂。

用聚乙二醇对蛋白质药物修饰具有很多优点：a)增大蛋白质药物的分子量，减少被肾小球过滤的频率，提高药物在体内的半衰期；b)保护蛋白质免受蛋白酶的降解；c)屏蔽外源性蛋白质的免疫原性，减少副作用；d)蛋白质被修饰后仍能保持一定的活性，通过在体内长时间循环，起到稳定的治疗效果；e)聚乙二醇是FDA已经批准的药用材料，只要解决修饰剂和修饰工艺中的关键技术，就能迅速得到批准并投入应用。

目前聚乙二醇化技术已发展到第二代------定点聚乙二醇化技术(Site-specific PEGylation)。定点聚乙二醇化技术可以特异地修饰蛋白药物的某一特定氨基酸，从而避免随机修饰的盲目性。这样既可以选择远离蛋白质多肽活性中心结构，减少非定点聚乙二醇化所带来的生物活性降低；又能选择性屏蔽某些抗原位点，减少免疫原性。同时，偶联物结构与活性保持高度一致。

发明内容

本发明所要解决的首要技术课题是提供一种有利于工业化生产，且能明显减少用药次数，用于治疗II 型糖尿病的长效药物。

本发明的技术方案：在rExendin-4非活性区C末端突变或插入一个Cys，以活化的Y型马来酰亚胺聚乙二醇衍生物为PEG修饰剂，rExendin-4中唯一的巯基加成到Y型PEG的马来酰亚胺的双键上，实现对蛋白质的定点修饰。

rExendin-4原序列SEQ见序列表。

本发明中rExendin-4改构体采用基因重组法，将Exendin-4原序列中第39位丝氨酸(Ser)基因突变为半胱氨酸(Cys)，或在其基因序列中终止密码子TGA前直接插入编码一个半胱氨酸的三联体密码子(TGT)，然后直接在大肠杆菌系统中发酵表达。与化学合成方法相比，生产简便，安全性好，无毒性试剂，制造成本低，且易于规模放大。

本发明所选用聚乙二醇分子为Y型马来酰亚胺聚乙二醇衍生物(结构见下)，分子量为40,000道尔顿。相比直链或其他分子量低于40,000的支链聚乙二醇衍生物，具有更长的体内半衰期。