[发明专利]用于检测禽流感病毒N9亚型的RT-PCR引物对、试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明属于病毒检测领域，涉及用于检测禽流感病毒N9亚型的引物对、试剂盒及检测方法。

背景技术

禽流感（avian influenza）是由禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）引起的一种主要流行于鸡群中的烈性传染病。高致病力毒株可致禽类突发死亡，是国际兽疫局规定的A类疫病，也能感染人。禽流感病毒属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)A型流感病毒属。根据核蛋白(NP)和基质蛋白(MP)的不同，流感病毒共分3个型，即A，B和C型，每个型内的毒株都有基本相同的NP和MP，也就是说NP和MP具有型特异性。AIV属A型流感病毒，在正粘病毒属中A型流感病毒是唯一感染禽类的病毒型。根据AIV囊膜表面糖蛋白血凝素和神经氨酸酶的不同可以分为好多亚型，目前已分离到17种特异的HA抗原(H1-H17)和10种不同的NA抗原(N1-N10)。禽流感不仅严重危害禽类，而且危害哺乳动物，尤其是可感染人并致人死亡，极大的威胁人类公共卫生安全。H7N9(Influenza A virus subtype H7N9)是一种甲型流感病毒，是禽流感病毒的一个亚型，因病毒在鸟类的死亡率低，经基因交换后转移到人类上感染后成为病发期短、重症率与死亡率均相对于SARS略高而引发社会注意。H7N9原属于低致病性病毒，仅在禽间发现，2013年3月下旬，人类感染甲型流感H7N9病毒的病例被发现，这是该病毒全球首次感染人类。目前，进行N9亚型分型的主要是神经氨酸酶抑制试验，耗时、麻烦等诸多问题，并且现有技术中并没有检测禽流感病毒N9亚型的RT-PCR检测试剂盒以及方法，因此，建立一种特异性强、敏感性高、可靠性好的检查方法意义重大。

发明内容

根据上述领域的需求和不足，本发明提供一种用于检测禽流感病毒N9亚型的引物对、试剂盒及检测方法。本发明所述引物对检测禽流感病毒N9亚型的特异性强、灵敏度高。

本发明通过以下技术方案实现的：

本文所列出的核苷酸序列，均由5’端向3’端方向书写。

本发明的一个方面提供一种引物对，所述引物对由两条引物组成，其中一条引物AIV-N9-F3包含如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，另一条引物AIV-N9-R3包含如SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列，所述核苷酸序列如下：

5’-GCTGGCCACTATCATCACC-3’（AIV-N9-F3，SEQ ID NO：3）；

5’-TCGTTCCCCGTAACATGA-3’（AIV-N9-R3，SEQ ID NO：6）。

本发明还提供包含上述引物对的组合物。

此外，本发明还提供一种用于检测禽流感病毒N9亚型的试剂盒，其特征在于，包含上述的组合物。

所述的试剂盒还包含RT-PCR反应液、酶混合液、所述的RT-PCR反应液由上述的引物对、反应缓冲液和dNTPs混合在一起；所述酶混合液由RNA酶抑制剂、反转录酶和Taq DNA聚合酶按3:2:10混合在一起。

所述试剂盒还包含一种X液，所述的X液为一对引物，所述引物对只要满足可对阳性对照的RNA进行扩增，扩增的片段长度与禽流感病毒N9亚型所检测的目的基因长度相同即可。

本发明中优选使用的X液为自行设计的引物对，其中一条引物包含如SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列，另一条引物包含如SEQ ID NO：8所示核苷酸序列。

本发明中优选使用的X液的上游引物N9UND-F：TGGAGTAGAGTACGCTCAGGC；下游引物N9UND-R：CCCAGTCGGTGTCGTTGTCTT

X液扩增的序列：