[发明专利]抗丙肝病毒药物高通量筛选模型及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及医学、基因工程和细胞生物学领域，具体地说，涉及一种抗丙肝病毒药物高通量筛选模型及其应用。

背景技术

HCV（Hepatitis C virus）是一种直到1989年才被首次报道的肝炎病毒（Choo等,1989），是一种单链RNA病毒，其导致的丙型肝炎是引起人类病毒性肝炎的主要原因之一。截止2005年在全球约有3%的人口，超过1.7亿人被丙型肝炎病毒感染。HCV是一种不导致细胞病变的肝脏的病毒，是黄病毒科的成员，被感染后可能发生急性肝炎，急性肝炎可被治愈，而另有约70%会发展成慢性肝炎，并最终导致肝硬化、肝癌等严重疾病（Hoofnagle等,2002）。目前为止，还没有开发出抗HCV疫苗，而且对于6个亚型一直没有广谱高效的药物。临床上主要采用PEG-IFN-α和Ribavirin联合治疗(Fried and Hoofnagle,1995;McHutchison,Gordon等,1998)，此疗法价格昂贵，并且只对其中某些亚型具有一定的疗效；2012年美国食品和药物管理局（Food and Drug Administration,FDA）批准上市了抑制HCV复制过程中的关键蛋白NS3/4A活性的小分子药物Telaprevir(VX-950)(Lin,Perni等,2006)和Boceprevir（SCH503034）（Njoroge,Chen等,2008），但是它们仅针对其中基因型I有比较好的疗效。

在针对HCV的研究方面，直到2005年，人类才分离出可以在体外培养的细胞中完成整个生命周期的HCVcc（Cell culture-derived infectious HCV，HCVcc），从此对于HCV机制的研究进入了一个高速发展的时期(Cai,Zhang等,2005;Heller,Saito等,2005;Lindenbach,Evans等,2005;Wakita and Kato,2006)。但是，因为HCV病毒并无细胞毒性，也没有明显的特征，所以就衍生出一系列针对HCV侵染的报告系统。因为在HCV的生命周期中，会首先转录出一条多蛋白的肽链，然后被不同的蛋白酶切开变成具有活性的蛋白，而其中最重要的蛋白酶当属HCV自带的NS3/4A，其能识别特定氨基酸序列并进行切割，于是报告系统和药物设计主要围绕NS3/4A展开。

2004年Laura Pacini报道了一种报告系统，其是基于SEAP-1，它被插入一段可以被NS3/4A特异识别的肽段，插入位置在SEAP-1和一个内质网膜锚之间，当被NS3/4A切开，SEAP-1可以被分泌到细胞周围的培养基中（Pacini等,2004）。该系统构建原理也是利用了NS3/4A的活性，不过其检测方法是通过ELISA检测细胞培养基中SEAP-1的活性，检测过程比较复杂也难以保证精确性。

2006年Breiman报道了一个基于内质网膜蛋白PERK偶联Gal4VP16的报告系统。PERK蛋白定位在内质网ER上，通过NS3/4A特异性酶切位点NS5A/5B之间肽段偶联Gal4VP16，当HCV侵入细胞并表达NS3/4A时，Gal4VP16被释放，并且启动报告基因的表达，报告基因可以是荧光、自杀基因等（Breiman等,2006）。

2008年第四军医大学一个研究组开发了一个基于细胞的指示NS3/4A活性的报告系统，该系统中将重组的Caspase3（启动细胞凋亡程序中其关键作用的酶，诱导细胞凋亡）中原本的酶切位点改为NS3/4A的特异性酶切位点，这样当细胞被HCV侵染后，细胞表达NS3/4A，剪切Caspase3前体并释放出有活性的Caspase3，诱导细胞凋亡，并最终通过MTT检验细胞的存活率（Lei等，2008）。该方法利用了细胞凋亡机制，但是其最大的缺陷在于效率过低，在其实验中只得到了45%的死亡率，并且采用质粒转染的方法植入系统，不够稳定。

2009年，Qingxia Han报道了一组基于对2a型HCVcc（JFH-1）进行改造的报告系统（Qingxia Han等,2009）。其在HCVcc基因组NS5A的C端插入了eGFP，从而使得宿主细胞被改造后的HCVcc侵染后发出绿色荧光。这套系统读数方便，而且可以荧光定量，但是构造过程复杂，并且只能针对可以在细胞体外培养的HCVcc这一种基因型，其他型别的HCV很难嫁接。