[发明专利]抗丙肝病毒药物高通量筛选模型及其应用

权利要求书

1.抗丙肝病毒药物高通量筛选模型，其特征在于，其构建方法包括以下步骤：

1）报告质粒的构建：以慢病毒包装质粒为骨架，其中至少串联连接有两个基因表达盒，一个基因表达盒用于表达rtTA-MAVS融合蛋白，另一个基因表达盒用于表达tight-TRE启动子下游的报告蛋白，两个基因表达盒之后连接有抗性基因，即构建得到报告质粒；

其中，rtTA为四环素调控反式激活子，MAVS为线粒体外膜蛋白；

2）采用慢病毒包装系统产生含有上述报告质粒的慢病毒，然后侵染HCV宿主细胞，将侵染的细胞作为针对HCV NS3/4A蛋白酶的抗丙肝病毒药物高通量筛选模型，向含有上述侵染细胞的培养基中加入待筛选的药物化合物，培养一段时间后，根据报告蛋白的表达和/或细胞的存活情况，来评价该药物化合物对丙肝病毒的抑制活性。

2.根据权利要求1所述的筛选模型，其特征在于，步骤1）中所述慢病毒包装质粒为pLentiCMVMCSSBsd，序列如Seq ID No.9所示。

3.根据权利要求2所述的筛选模型，其特征在于，步骤1）中用于表达rtTA-MAVS融合蛋白的基因表达盒位于SV40启动子下游，且该融合蛋白的C端连有内部核糖体进入位点序列IRES。

4.根据权利要求2所述的筛选模型，其特征在于，步骤1）中所述报告蛋白为mCherry荧光蛋白和自杀基因Delta-tk之间通过2A序列连接；

其中，自杀基因Delta-tk的核苷酸序列如Seq ID No.2所示，2A序列如Seq IDNo.3所示。

5.根据权利要求1所述的筛选模型，其特征在于，步骤1）中所述抗性基因为杀稻瘟菌素抗性基因。

6.根据权利要求1-5任一项所述的筛选模型，其特征在于，步骤1）中构建得到的报告质粒为pLenti-TK-mCherry-rtTA-MAVS，其核苷酸序列如Seq ID No.8所示。

7.根据权利要求1所述的筛选模型，其特征在于，步骤2）中所述HCV宿主细胞为Huh7.5细胞，培养细胞所使用的培养基为DMEM，其中还含有10%FBS、1×NEAA、1×青霉素链霉素双抗溶液和2μg/ml强力霉素，细胞培养条件为37℃，5%CO₂。

8.根据权利要求1所述的筛选模型，其特征在于，步骤2）中使用流式细胞仪检测报告蛋白的表达和/或细胞的存活情况。

9.权利要求1-8任一项所述的筛选模型在抗丙肝病毒药物高通量筛选中的应用。

10.权利要求1-8任一项所述的筛选模型在研究HCV侵染宿主细胞的分子机制中的应用。