[发明专利]一种AS-PCR引物设计方法、基因多态性检测方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于核酸诊断试剂领域，具体涉及一种等位基因特异性聚合酶链式反应（AS-PCR）引物设计方法。本发明还涉及一种AS-PCR基因多态性检测方法及试剂盒，所述方法及试剂盒用于对可能（即怀疑）包含等位基因变异区域的靶序列进行检测以确定等位基因变体是否存在。

背景技术

等位基因特异性寡核苷酸分析法（allele-specific oligonucleotide,ASO）是基于杂交的突变检测技术，常用以检测已知突变。设计一段例如15～20bp的寡核苷酸片段，其中包含了发生已知突变的部位，以此为探针，当与固定在膜上的样品DNA杂交时，由于一个碱基的差异会导致Tm值下降5～7.5℃，因此通过严格控制杂交条件，可以鉴定出样品DNA中是否存在突变。

将ASO与PCR相结合的等位基因特异性聚合酶链式反应（AS-PCR）是目前一种常用于分析基因多态性，特别是单核苷酸多态性（SNP）的方法。多态性（polymorphism）是指在一个生物群体中，同时和经常存在两种或多种不连续的变异型或基因型（genotype）或等位基因（allele），亦称遗传多态性（genetic polymorphism）或基因多态性。从本质上来讲，多态性产生于基因水平上的变异，一般发生在基因序列中不编码蛋白的区域和没有重要调节功能的区域。单核苷酸多态性（SNP），即散在的单个碱基的不同，包括单个碱基的缺失、插入和置换，其中以单个碱基置换的情形居多。SNP是目前倍受关注的一类多态性，由于其经常在遗传疾病、疾病易感性、药物不良反应性等研究中具有遗传标记的作用，因此，其检测为疾病诊断和早期诊断，药物学研究等提供了巨大的潜在可能。

在AS-PCR中，PCR的引物之一或者两个引物被设计成在序列变异的位点处退火，使其能够区分同一基因的不同等位基因，这些等位基因类型包括碱基的替换、插入和缺失。AS-PCR利用了DNA聚合酶的保真度：相比于3’端最后一个碱基正确匹配引物而言，3’端最后一个碱基错配的引物在延伸效率上大大降低（通常为1/100至1/100,000）。3’端最后一个碱基错配的引物由此导致延伸困难，PCR扩增减少，因此很容易通过检测区分突变。

传统AS-PCR的引物3’端最后一个碱基特别关键，必须为基因多态性位点。以检测SNP为例，其原理如图1所示。图1A中，针对包含SNP位点的靶序列设计等位基因特异性引物（下称AS引物）1-1、1-2，即，在常规PCR引物设计基础上，使待测SNP位点恰好位于AS引物1-1、1-2的3’末端，即引物1-1与1-2仅3’末端的碱基不同（分别对应野生型和可能的突变型），其余碱基序列一致，其中5’端X代表碱基上的羟基或磷酸基，3’端Y代表碱基上的羟基。图1B中，2-1和2-2分别为等位基因所在的野生型和突变型DNA双链，其中2-1b和2-2b分别为与AS引物配对的模板链。如图1C所示，按照3’端最后一个碱基严格互补配对的原理，实现等位基因的特异性扩增。也就是说，若图1A中的AS引物与图1B中的模板完全互补配对，则形成图1C中3-1、3-2所示双链结构，PCR反应顺利进行，若形成图1C中3-3、3-4所示情况，3’末端碱基错配，则PCR反应不可进行。通过分析PCR扩增结果，判定SNP情况，若引物1-2扩增而引物1-1无明显扩增，则表明存在所述突变。

传统AS-PCR对DNA聚合酶的要求比较高。PCR（非AS-PCR）反应体系中常用的DNA聚合酶有A型和B型两种，A型DNA聚合酶具有5’端到3’端的DNA聚合酶活性，如Taq DNA聚合酶等；B型DNA聚合酶不但具有5’端到3’端的DNA聚合酶活性，还具有3’端到5’端的DNA外切酶活性，可以即时识别并切除3’端的错配碱基（因错配导致翘起），从而剩下未错配的碱基得以继续扩增，例如pfu DNA聚合酶、KOD DNA聚合酶，等等。由于传统AS-PCR正需要利用多态性位点的错配引物，故而扩增反应中仅能使用A型DNA聚合酶，不能使用会将错配碱基切除的B型DNA聚合酶。