[发明专利]一种AS-PCR引物设计方法、基因多态性检测方法及试剂盒

权利要求书

1.一种AS-PCR引物的设计方法，所述方法包括以下步骤：

（i）针对包含待测等位基因变异区域的靶序列设计AS-PCR引物；

（ii）对步骤（i）所设计的AS-PCR引物进行修饰，使所述AS-PCR引物的3’端最后一个碱基带有能够屏蔽所述AS-PCR引物直接延伸的基团。

2.一种AS-PCR基因多态性检测方法，所述方法用于对可能包含等位基因变异区域的靶序列进行检测以确定等位基因变体是否存在，其特征在于所述方法包括以下步骤：

（i）针对所述可能包含等位基因变异区域的靶序列设计AS-PCR引物；

（ii）对步骤（i）所设计的AS-PCR引物进行修饰，使所述AS-PCR引物的3’端最后一个碱基带有能够屏蔽所述AS-PCR引物直接延伸的基团；

（iii）使用步骤（ii）所修饰的AS-PCR引物对所述靶序列进行PCR扩增，所述PCR扩增使用B型DNA聚合酶；

（iv）分析步骤（iii）的扩增结果确定所述等位基因变体是否存在。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤（i）中所述等位基因变异区域位于所述AS-PCR引物的3’端的第1～6个碱基中，所述引物的长度为18bp～30bp。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其中使在扩增反应中所述AS-PCR引物的5’端到所述等位基因变异区域的Tm值为48℃～52℃。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤（ii）对所述AS-PCR引物3’端的修饰包括但不限于脱羟基、羟基位置修饰氨基、羟基位置修饰羧基、羟基位置修饰巯基或羟基位置修饰磷酸基。

6.根据权利要求5所述的方法，其中步骤（ii）对所述AS-PCR引物3’端的羟基位置修饰为标记荧光淬灭基团，并且步骤（ii）进一步包括对所述AS-PCR引物的5’端标记荧光基团。

7.根据权利要求6所述的方法，其中标记所述AS-PCR引物5’端的所述荧光基团选自下列物质所构成的组：FAM、VIC、HEX、ROX、Taxas Red或CY5，标记所述AS-PCR引物3’端的所述荧光淬灭基团选自下列物质所构成的组：BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcyle、Temra或Eclipse。

8.根据权利要求2至7中任一项所述的方法，其中步骤（iii）的所述B型DNA聚合酶为pfu DNA聚合酶或KOD DNA聚合酶。

9.一种AS-PCR基因多态性检测试剂盒，其中至少包含以下成分：

a.根据权利要求2至8中任一项所述的方法步骤（i）-（ii）所设计的AS-PCR引物；

b.根据权利要求2至8中任一项所述的方法步骤（iii）中使用的B型DNA聚合酶。