[发明专利]用于检测犬巴贝西虫的引物组合、试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明具体涉及一种用于检测犬巴贝西虫的引物组合，以及含有该引物组合的试剂盒，同时还涉及采用该引物组合检测犬巴贝西虫的方法，属于生物检测技术领域。

背景技术

巴贝西虫病是一种经蜱传播的血源性原虫病，广泛发生于各种家畜。其在家畜体内单个或成对寄生于红细胞内，有可能引起严重的贫血和血红蛋白尿症。引起犬的巴贝西虫病的病原体有3种，即犬巴贝西虫(Babeisa canis)、韦氏巴贝西虫（B.vitlli）和吉氏巴贝西虫（B.gibsoni）。犬巴贝西虫分布于欧洲、美洲和印度，韦氏巴贝西虫分布于南美洲，吉氏巴贝西虫分布于亚洲。我国主要流行的虫种为吉氏巴贝西虫，目前在国内分布广泛，有蜱滋生的地方，春、夏、秋季均可发病。

目前，血液原虫检测方法主要有涂片染色镜检、酶联免疫反应、间接荧光、LAMP、多聚酶链式反应（PCR）等。涂片染色镜检法对检测设备的要求较低，操作简便，但是检测率较低。LAMP技术检测简单快速，肉眼即可直接观察结果，但易于出现假阳性，且不易鉴定虫体的种类。而PCR技术以其较高的特异性和灵敏性被认为是检测巴贝西虫的最有效方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测犬巴贝西虫的引物组合。

同时，本发明还提供一种用于检测犬巴贝西虫的试剂盒。

最后，本发明提供一种检测犬巴贝西虫的方法。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：

一种用于检测犬巴贝西虫的引物组合，由外引物和内引物组成，外引物为：

正向引物：5’-GGCTTTCGGTGATTCATA-3’（如SEQ ID NO:1所示），

反向引物：5’-CCTTCCGTCAATTCCTTT-3’（如SEQ ID NO:2所示）；

内引物为：

正向引物：5’-TGGACCATTCAAGTTTCTG-3’（如SEQ ID NO:3所示），

反向引物：5’-TCGTCTTCGATCCCCTA-3’（如SEQ ID NO:4所示）。

一种用于检测犬巴贝西虫的试剂盒，主要包括由外引物和内引物组成的引物组合，外引物为：

正向引物：5’-GGCTTTCGGTGATTCATA-3’，

反向引物：5’-CCTTCCGTCAATTCCTTT-3’；

内引物为：

正向引物：5’-TGGACCATTCAAGTTTCTG-3’，

反向引物：5’-TCGTCTTCGATCCCCTA-3’。

具体的，用于检测犬巴贝西虫的试剂盒，还可以包括Taq酶、Mg^2＋、mix dNTP、缓冲液（如10×PCR Buffer）、DNA Marker（标准品）及试剂盒反应条件说明书等。

更具体的，用于检测犬巴贝西虫的试剂盒，包括：Taq酶100U、10×PCR Buffer500μL、25mmol.L^-1Mg^2＋盐500μL、10mmol.L^-1mix dNTP100μL、10pmol·μL^-1引物组合（包括内外引物正反向）各100μL。

一种检测犬巴贝西虫的方法，包括以下步骤：

（1）以待检测DNA样品为模板，采用引物组合进行套式PCR扩增；

（2）取扩增产物进行凝胶电泳，根据电泳结果判定样品中是否含有犬巴贝西虫；

所述步骤（1）中引物组合由外引物和内引物组成，外引物为：

正向引物：5’-GGCTTTCGGTGATTCATA-3’，

反向引物：5’-CCTTCCGTCAATTCCTTT-3’；

内引物为：

正向引物：5’-TGGACCATTCAAGTTTCTG-3’，

反向引物：5’-TCGTCTTCGATCCCCTA-3’。

所述步骤（1）中采用引物组合进行套式PCR扩增的反应体系为：

第一次PCR：50μL体系，Taq酶1U、10×PCR Buffer5μL、25mmol/L Mg^2＋4μL、10mmol/L mix dNTP1μL、10pmol/μL外引物正反向引物各1μL、待检测DNA样品1μL，加ddH₂O至50μL；