[发明专利]用于检测犬巴贝西虫的引物组合、试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种用于检测犬巴贝西虫的引物组合，其特征在于：由外引物和内引物组成，外引物为：

正向引物：5’-GGCTTTCGGTGATTCATA-3’，

反向引物：5’-CCTTCCGTCAATTCCTTT-3’；

内引物为：

正向引物：5’-TGGACCATTCAAGTTTCTG-3’，

反向引物：5’-TCGTCTTCGATCCCCTA-3’。

2.一种用于检测犬巴贝西虫的试剂盒，其特征在于：主要包括由外引物和内引物组成的引物组合，外引物为：

正向引物：5’-GGCTTTCGGTGATTCATA-3’，

反向引物：5’-CCTTCCGTCAATTCCTTT-3’；

内引物为：

正向引物：5’-TGGACCATTCAAGTTTCTG-3’，

反向引物：5’-TCGTCTTCGATCCCCTA-3’。

3.根据权利要求2所述的用于检测犬巴贝西虫的试剂盒，其特征在于：还包括Taq酶、Mg^2＋、mix dNTP及缓冲液。

4.根据权利要求3所述的用于检测犬巴贝西虫的试剂盒，其特征在于：包括：Taq酶100U、10×PCR Buffer500μl、25mmol.L^-1Mg^2＋盐500μL、10mmol.L^-1mix dNTP各100μL、10pmol·μL^-1引物组合各100μL。

5.一种检测犬巴贝西虫的方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）以待检测DNA样品为模板，采用引物组合进行套式PCR扩增；

（2）取扩增产物进行凝胶电泳，根据电泳结果判定样品中是否含有犬巴贝西虫；

所述步骤（1）中引物组合由外引物和内引物组成，外引物为：

正向引物：5’-GGCTTTCGGTGATTCATA-3’，

反向引物：5’-CCTTCCGTCAATTCCTTT-3’；

内引物为：

正向引物：5’-TGGACCATTCAAGTTTCTG-3’，

反向引物：5’-TCGTCTTCGATCCCCTA-3’。

6.根据权利要求5所述的检测犬巴贝西虫的方法，其特征在于：所述步骤（1）中采用引物组合进行套式PCR扩增的反应体系为：

第一次PCR：50μL体系，Taq酶1U、10×PCR Buffer5μL、25mmol/L Mg^2＋4μL、10mmol/L mix dNTP1μL、10pmol/μL外引物正反向引物各1μL、待检测DNA样品1μL，加ddH₂O至50μL；

第二次PCR：50μL体系，Taq酶1U、10×PCR Buffer5μL、25mmol/L Mg^2＋4μL、10mmol/L mix dNTP1μL、10pmol/μL内引物正反向引物各1μL、第一次PCR扩增产物1μL，加ddH₂O至50μL。

7.根据权利要求6所述的检测犬巴贝西虫的方法，其特征在于：所述的第一次PCR的反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸1min，进行25个循环，72℃延伸10min，冷却结束反应。

8.根据权利要求6所述的检测犬巴贝西虫的方法，其特征在于：所述的第二次PCR的反应程序为：95℃预变性5min，94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min，进行30个循环，72℃延伸7min，冷却结束反应。

9.根据权利要求5所述的检测犬巴贝西虫的方法，其特征在于：所述步骤（2）中凝胶电泳采用1.0%EB染色的琼脂糖凝胶。