[发明专利]猪圆环病毒2型高敏感性PK15细胞系L8的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及促进2型猪圆环病毒体外细胞增殖技术领域。具体涉及猪圆环病毒2型高敏感性单细胞株的筛选及培养。

背景技术

猪圆环病毒2型(porcine cirovirus type 2，PCV2)可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征、增生性坏死性肺炎、母猪繁殖与呼吸综合征、猪皮炎与肾病综合征和仔猪传染性先天性震颤等多种疾病，其中断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）最为常见且该病在世界范围内广泛流行，给各国养猪业造成了巨大的损失。此外，猪圆环病毒2型又常造成其他细菌或病毒的并发或继发感染，从而增加了猪传染病的预防和控制难度。

由于猪圆环病毒2型体外细胞增殖比较困难，其病毒滴度一般都在10^4.0 —10^5.0TCID₅₀/mL之间，免疫荧光染色显示接种PCV2的PK15细胞中仅有20%左右的细胞对PCV2易感。这可能是制约PCV2全病毒灭活苗疫苗开发的技术瓶颈，因此研究提高PCV2在细胞内增殖滴度的方法成了国内外学者研究的热点和难点，同时也成为了全病毒灭活苗开发所需要克服的最大障碍。

发明内容

本发明的目的是获得对猪圆环病毒2型具有较高敏感性的细胞株，通过对该细胞株的克隆、筛选与生物学特性的测定进一步验证其功能，并增殖获得具有较高滴度的猪圆环病毒2型细胞毒。

本发明涉及基于对所筛选出的细胞生物特性以及其对猪圆环2型病毒增殖促进情况的检测。所述的克隆细胞能够提高猪圆环病毒2型的体外增殖能力和滴度，有利于进一步研究猪圆环病毒2型体外复制、体外诊断及开发通过悬浮培养技术制备高效价PCV2全病毒灭活疫苗。

本发明的技术方案是：通过系列稀释法克隆获得单细胞株，并进一步通过间接免疫荧光（IFA）筛选出对PCV2高敏感性的单细胞株。一种猪圆环病毒2型高敏感性PK15细胞系L8的制备方法，它的步骤如下：

（1）将PK15细胞复苏后培养于细胞瓶中长成细胞单层，用质量分数为0.25%的胰酶消化，然后加入DMEM生长液吹打，所述DMEM生长液含质量分数为10%的胎牛血清和质量分数为1%的双抗，分散细胞成单个，用系列稀释法进行细胞克隆；

（2）通过间接免疫荧光筛选出对PCV2高敏感性的单细胞株。

所述步骤（1）中用系列稀释法进行细胞克隆的步骤如下：

① 将PK15细胞稀释到5x10⁴ 至 1x10⁵cells/mL，在96孔板中，除了A1孔其他所有孔用八孔排枪加入100μL DMEM生长液，取稀释好的PK15细胞液200μL加入到A1孔中；

② 第一系列的稀释：如图1中竖向箭头所示，在A1孔中取100μL 至B1中进行倍比稀释，用枪吸吹混匀，同样取100μL至C1孔中，以此类推进行倍比稀释至H1孔后，最后从H1孔中取出100μL细胞混合液弃掉；

第二系列的稀释：如图1中横向箭头所示，在第一系列稀释完之后，用八孔排枪取100μL细胞培养液加入到第一排中进行倍比稀释并吸吹混匀之后，再从第一排孔中取100μL细胞混合液至第二排中进行同样操作；同样进行倍比稀释至第十二排孔，弃掉最后取出的100μL细胞混合液；

③ 在96孔板中补加DMEM生长液至200μL，将培养板置于37℃ 5%CO₂培养箱中培养，培养4—5d时可在显微镜下挑出单克隆细胞孔并分别按照挑选的前后顺序命名为L1、L5、L6、L8、L12和L15，继续培养10d即细胞长满孔的1/3-1/2面积时可将细胞转至24孔板中培养，细胞在24孔板中长满后可转至6孔板中培养，细胞在6孔板中长满再转至25cm²的细胞瓶中培养，在细胞培养过程中2—3d更换一次DMEM生长液，将培养的单细胞克隆冻存。

本发明的有益效果是：本发明采用更为方便高效的单细胞克隆技术获得一株对PCV2具有更高感染率的细胞系，命名为L8。通过对该细胞系的稳定性以及纯净性检测发现该细胞系能够稳定的提高PCV2在细胞内的增殖滴度。