[发明专利]猪圆环病毒2型高敏感性PK15细胞系L8的制备方法

权利要求书

1.一种猪圆环病毒2型高敏感性PK15细胞系L8的制备方法，其特征在于，它的步骤如下：

（1）将PK15细胞复苏后培养于细胞瓶中长成细胞单层，用质量分数为0.25%的胰酶消化，然后加入DMEM生长液吹打，所述DMEM生长液含质量分数为10%的胎牛血清和质量分数为1%的双抗，分散细胞成单个，用系列稀释法进行细胞克隆；

（2）通过间接免疫荧光筛选出对PCV2高敏感性的单细胞株。

2.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型高敏感性PK15细胞系L8的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中用系列稀释法进行细胞克隆的步骤如下：

① 将PK15细胞稀释到5x10⁴ 至 1x10⁵cells/mL，在96孔板中，除了A1孔其他所有孔用八孔排枪加入100μL DMEM生长液，取稀释好的PK15细胞液200μL加入到A1孔中；

② 第一系列的稀释：在A1孔中取100μL 至B1中进行倍比稀释，用枪吸吹混匀，同样取100μL至C1孔中，以此类推进行倍比稀释至H1孔后，最后从H1孔中取出100μL细胞混合液弃掉；

第二系列的稀释：在第一系列稀释完之后，用八孔排枪取100μL细胞培养液加入到第一排中进行倍比稀释并吸吹混匀之后，再从第一排孔中取100μL细胞混合液至第二排中进行同样操作；同样进行倍比稀释至第十二排孔，弃掉最后取出的100μL细胞混合液；

③ 在96孔板中补加DMEM生长液至200μL，将培养板置于37℃ 5%CO₂培养箱中培养，培养4—5d时可在显微镜下挑出单克隆细胞孔并分别按照挑选的前后顺序命名为L1、L5、L6、L8、L12和L15，继续培养10d即细胞长满孔的1/3-1/2面积时可将细胞转至24孔板中培养，细胞在24孔板中长满后可转至6孔板中培养，细胞在6孔板中长满再转至25cm²的细胞瓶中培养，在细胞培养过程中2—3d更换一次DMEM生长液，将培养的单细胞克隆冻存。