[发明专利]含天蚕素AD和BuforinⅡ的抗菌肽复合液的生产及纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程领域，具体是一种有关抗菌肽复合液的生产及纯化方法。

背景技术：

抗菌肽是生物体受到外界病原微生物入侵时产生的具有抗菌活性的阳离子多肽，是生物先天免疫重要的组成部分。抗菌肽对细菌有很强的杀伤作用，尤其是其对某些耐药性病原菌的杀灭作用更引起了人们的重视，并且抗菌肽还具有分子量低、水溶性好、热稳定、抗菌谱广、不易产生耐药性等特点，显示出了在医药、食品、农业等领域良好的应用前景。

天蚕素AD(Cecropin AD，CAD)是人工合成的由Cecropin A的N端1～11肽段和Cecropin D的C端12～37肽段组成的杂合肽，其能够作用于细菌细胞膜来发挥杀菌作用。抗菌肽BuforinⅡ是韩国学者Park等从亚洲蟾蜍的胃组织中分离纯化的有21个残基的抗菌肽，其抗菌活性很强，抗菌谱广，在不破坏细胞膜的前提下，高效穿过细胞膜后进入胞质强烈结合DNA，从而抑制微生物的生长。研究表明,上述两种抑菌机理不同的抗菌肽协同作用，能够有效的增强抑菌效果。

由于从动物或微生物中提取抗菌肽的产量少，成本高，所以用现代生物技术表达抗菌肽成为目前研究的热点。大肠杆菌系统因为遗传背景清楚、营养要求简单、生长速度快等优点，有利于重组蛋白的大规模生产，成为大量生产抗菌肽的首选途径。

大肠杆菌Trx-PC6/BL21（CGMCC No.4588 ）是将载有表达上述两种抗菌肽的基因的质粒pET-Trx-CAD-Buforin II转化到宿主细胞E.coli BL21(DE3)plysS中，得到的一株具有高效等比例表达含两种不同抑菌机制的抗菌肽能力的工程菌。

在大肠杆菌表达系统中，人们常常用 IPTG（异丙基-β-D-巯基半乳糖苷）作为表达诱导剂。然而，IPTG 不仅价格昂贵，而且具有潜在毒性，不利于应用于大规模生产。乳糖因其无毒、廉价等优点可作为IPTG的替代品用于诱导蛋白表达。与IPTG不同的是，乳糖必须借助于乳糖通透酶的作用进入细胞，并经过β-半乳糖苷酶的作用转化为半乳糖才能发挥诱导作用。而且，乳糖会作为碳源进入大肠杆菌的代谢途径而被逐渐消耗。因此，通常情况下，乳糖的诱导效果不如IPTG的诱导效果好，以乳糖作为诱导剂进行抗菌肽表达的研究也都停留在实验室阶段。而且，目前的研究采用的乳糖的诱导方式通常是在菌体生长到一定阶段再中途加入乳糖进行诱导。这种诱导方式操作繁琐，重复性差，还有染菌的风险。

另外，由于受到表达效率、生产成本等各种因素的影响，抗菌肽的研究开发工作尚不尽如人意。因此，如何提高抗菌肽的表达效率，降低生产成本，成为目前亟待解决的问题。而抗菌肽的纯化成本在其生产成本中占有非常重要的比重。研究抗菌肽的纯化工艺对于降低抗菌肽生产成本，推动抗菌肽的产业化具有举足轻重的作用。

发明内容：

本发明所要解决的技术问题，就是针对现有技术所存在的不足，而提供一种从大肠杆菌表达系统出发，采用乳糖自诱导方式高效表达含等比例的两种不同抑菌机制的抗菌肽复合液，并将其分离纯化的生产工艺，实现了降低生产成本，提高抗菌肽得率。

本方案是通过如下技术措施来实现的：

本发明采用的表达pET-Trx-CAD-Buforin II的工程菌株Trx-PC6/BL21，具有氯霉素抗性，已保藏于“中国普通微生物菌种保藏管理中心”，保藏编号为CGMCC No.4588，具有氯霉素抗性。

从该工程菌株出发，经过发酵生产和分离纯化得到天蚕素AD和BuforinⅡ的抗菌肽复合液， 其中发酵生产包括的步骤有活化、种子培养和发酵培养，

而分离纯化包括的步骤有发酵液浓缩、菌体收集、菌体破碎、蛋白质分离和蛋白质鉴定。

具体步骤如下，

1、活化：冷冻甘油管保存的大肠杆菌Trx-PC6/BL21划线接种于LB平板（1%蛋白胨，1% NaCl，0.5%酵母粉，1.5%琼脂粉），33-38℃培养8-12 h。

2、种子培养：将上述平板上长出的单菌落接入含有终浓度为80-120 μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基（1%蛋白胨，1%NaCl，0.5%酵母粉）中，33-38℃，150-220 r/min转速震荡培养。