[发明专利]含天蚕素AD和BuforinⅡ的抗菌肽复合液的生产及纯化方法

权利要求书

1.含天蚕素AD和BuforinⅡ的抗菌肽复合液的生产及纯化方法，本方法以保藏编号为CGMCC No.4588的工程菌为出发菌种，经过发酵生产和分离纯化得到天蚕素AD和BuforinⅡ的抗菌肽复合液，其特征是：

所述的发酵生产包括的步骤有活化、种子培养和发酵培养，

所述的分离纯化包括的步骤有发酵液浓缩、菌体收集、菌体破碎、蛋白质分离和蛋白质鉴定。

2.根据权利要求1所述的含天蚕素AD和BuforinⅡ的抗菌肽复合液的生产及纯化方法，其特征是：

所述的活化步骤使用的培养基为LB培养基；

所述的种子培养步骤使用的培养基为含有终浓度为80-120 μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基；

所述的发酵培养步骤使用的培养基为Na₂HPO₄ 44.75 g/L、KH₂PO₄ 17 g/L、(NH₄)₂SO₄ 70 g/L、MgSO₄ 4.9 g/L、酵母粉 55 g/L、80-120 μg/mL的氨苄青霉素、1-3 g/L的葡萄糖、5-20 g/L的木糖和0.1-0.5 g/L的乳糖；

所述的发酵液浓缩采用陶瓷膜过滤；

所述的菌体破碎使用的缓冲液为0.1%Triton X-100，100 mM NaCl， 25 mM Tris-HCl和0.2 M NaOH；

所述的蛋白分离采用疏水柱洗脱；

所述的蛋白质鉴定采用管碟法。

3.根据权利要求2所述的含天蚕素AD和BuforinⅡ的抗菌肽复合液的生产及纯化方法，其特征是：

所述的陶瓷膜过滤采用的Exekia Membralox陶瓷膜，浓缩工艺条件为恒定过滤温度25-35℃，切向流设定为3-7 m/s，保持回流阀开放，滤出阀关闭，保持发酵液在系统内循环，待系统稳定后缓慢打开滤出阀，将初始过膜压力设定在0.5-1.2 Bar，滤出液返回原料罐，运行15-30 min以上，将发酵液浓缩10-15倍左右为止，

所述的疏水柱洗脱工艺为将菌体破碎液经过0.22μm的纤维素薄膜过滤后，上样到经过上样缓冲液[Na₂HPO₄ 50mM，（NH₄）₂SO₄  2M]平衡30-60 min的HiTrap Pennyl FF的疏水柱中，然后利用上样缓冲液和50 mM的Na₂HPO₄溶液混合梯度洗脱，收集洗脱得到的蛋白峰，

所述的管碟法为单层平板，表面涂布菌体的方法。