[发明专利]一种磁性纳米颗粒对核酸的提取方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种磁性纳米颗粒对核酸的提取方法和应用，属于分子生物学技术领域。

背景技术

当代生物学，医学研究等已经深入到分子水平，比如核酸层面，高效的核酸提取分离技术显得尤为重要。比如在血清／血浆等体液中筛查miRNA肿瘤标志物的研究，就需要一种简单高效的miRNA提取技术。

目前最常规的技术是经典的酚／氯仿提取方法，利用萃取的原理，分离出核酸。但是酚／氯仿这些有机溶剂对人体有巨大的毒害，对环境的影响也不利，而且操作过程复杂，结果受人为因素影响较大，不易实现自动化操作。

另外还有一些商业公司提供基于离心柱法的提取试剂盒，将样品过柱，利用核酸在不同条件下和柱子的吸附能力不同，达到分离的效果。操作也比较复杂，得率偏低，不易实现自动化操作。

也有一些商业化的磁珠法提取试剂盒，基于纳米磁珠的超高比表面积，利用静电引力等物理特性实现核酸的分离纯化，但是这些试剂盒的提取过程还是比较复杂，步骤繁多，而且尚未有专门针对miRNA提取的产品出现，现有的试剂盒的提取效果也难以让人满意。

发明内容

鉴于上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的是提出一种磁性纳米颗粒对核酸的提取方法和应用，能够提取miRNA，能够提高核酸的提取效率，能够简化操作以利于实现自动化提取。

本发明的目的通过以下技术方案得以实现：

一种磁性纳米颗粒对核酸的提取方法，包括如下步骤：

步骤一，使用裂解缓冲液裂解样品，得到样品裂解液，其中，裂解缓冲液的用量和样品的用量的比例关系为每40μL的裂解缓冲液对应10⁶细胞数量的样品；

步骤二，将5μL-100μL的磁性纳米颗粒的溶液加入到20μL-100μL所得的样品裂解液中，再加入20μL-500μL的结合缓冲液，混匀，转移入离心管中，放置在磁力架上磁性分离10秒-50秒，待磁性纳米颗粒吸附分离核酸后，移除液体，得到吸附了核酸的磁性纳米颗粒；

步骤三，向吸附了核酸的磁性纳米颗粒中加入50μL-200μL的洗涤缓冲液，混匀，放置在磁力架上磁性分离10秒-50秒，待至少一次的洗涤后，移除液体；

步骤四，向洗涤过后的吸附了核酸的磁性纳米颗粒中加入20μL-50μL的洗脱缓冲液，混匀，放置在磁力架上磁性分离10秒-50秒，待充分洗脱后收集洗脱液，核酸即在所得洗脱液中。

上述的提取方法中，样品包括细胞、组织、石蜡切片，对于核酸游离的样本则不需要裂解，比如血清、血浆和尿液，直接进行步骤二的操作。对于细胞样品，需要先收集培养细胞，离心，去上清液，然后再加入裂解缓冲液进行步骤一的操作。对于石蜡切片需要先添加二甲苯溶解，然后离心移除二甲苯，水溶液反复清洗两遍再再加入裂解缓冲液进行步骤一的操作。

上述的磁性纳米颗粒对核酸的提取方法中，优选的，所述裂解缓冲液包含如下组分：十二烷基硫酸钠（SDS）0.05wt%-0.5wt％、异硫氰酸胍（GITC）0.1M-4M、蛋白酶k 10μg/mL-800μg/mL、EDTA 1mmol/L-10mmol/L，NaCl 10mmol/L-150mmol/L。

上述的磁性纳米颗粒对核酸的提取方法中，优选的，所述裂解缓冲液包含如下组分：十二烷基硫酸钠0.05wt％，异硫氰酸胍0.5M，蛋白酶k 800μg/mL，EDTA 10mmol/L，NaCl 150mmol/L。

上述的磁性纳米颗粒对核酸的提取方法中，优选的，所述结合缓冲液包含如下组分：NaCl 0.5M-5M，异硫氰酸胍0.01M-4M，磷酸氢二钠–柠檬酸缓冲液调整结合缓冲液pH为2.2-6。

上述的磁性纳米颗粒对核酸的提取方法中，优选的，所述结合缓冲液包含如下组分：NaCl 3M，异硫氰酸胍0.05M，磷酸氢二钠–柠檬酸缓冲液调整结合缓冲液的pH为4。

上述的磁性纳米颗粒对核酸的提取方法中，优选的，所述洗涤缓冲液包含如下组分：NaCl 0.5M-5M，异硫氰酸胍0.05M-0.5 M，乙醇10v％-70v％，磷酸缓冲液调整洗涤缓冲液pH为2.2-6。

上述的磁性纳米颗粒对核酸的提取方法中，优选的，所述洗涤缓冲液包含如下组分：NaCl 1M，异硫氰酸胍0.05M，乙醇20v％，磷酸缓冲液调整洗涤缓冲液pH为5。

上述的磁性纳米颗粒对核酸的提取方法中，优选的，所述洗脱缓冲液为pH8.0-10.0的Tris-盐酸缓冲液。优选的，所述洗脱缓冲液为pH10.0的Tris-盐酸缓冲液。