[发明专利]一种基因组DNA提取方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及基因组DNA提取试剂盒及提取方法。

背景技术

自PCR扩增技术发明以来，生物分子学的研究突飞猛进。对基因的研究己经遍及医疗健康、农业生产、环境保护及生物各学科领域。基因组DNA的提取是分子生物学研究的前提，在上述各领域中广泛应用。提取基因组DNA常用的方法是用物理方法破壁，例如液氮研磨和高温加热；或者是酶解，例如溶菌酶酶解；或者非离子表面活性剂处理例如，CTAB法（Walker WH等，1991）氯化苄法和SDS法（林福呈和王洪凯，2010），细胞破壁和破膜后利用有机溶剂使用苯酚、氯仿、异戊醇的混合溶液使蛋白质变性达到与DNA分离的目的。虽然这些方法能够提取出高质量的基因组DNA，但是提取过程中的这些有机溶剂对人体皮肤、呼吸道粘膜、眼睛等有较大的伤害，而且提取的基因组常有有机溶剂残留，使得后面的实验结果不稳定；后来又出现了利用DNA吸附材料来达到蛋白质与DNA分离的目的，同时也开发了很多试剂盒来提取不同材料的基因组，虽然提取的基因组质量很高但成本较高、通用性不强。但是不论是使用苯酚、氯仿等有机溶剂抽提还是使用DNA提取试剂盒来提取基因组，样品的预处理始终是一个繁琐和耗时的过程。革兰氏阳性细菌和酵母菌细胞壁非常坚实，常见的提取基因组方法中都会加入溶菌酶消化细胞壁。对于人类和动物组织，需要加入蛋白酶K过夜处理使组织更分散。对于植物组织和丝状真菌菌丝或者是真菌孢子，需要使用液氮研磨破壁。

发明内容

为了克服上述问题，本发明提供了一种快速基因组DNA提取试剂盒及其制备方法，该方法可以针对绝大多数生物样品，操作简单、经济、无毒无污染，高质高效。

一种基因组DNA提取试剂盒，包括溶液A（裂解液）、溶液B（DNA结合液）、溶液C（DNA洗涤液）和溶液D（DNA洗脱液）；

溶液A（裂解液）：10mM-50mM Tris-HCl pH8.0，10mM-50mM EDTA，1%-10%（w/v）SDS，2M-4M NaCl，0.5%-2%（v/v）的β-巯基乙醇；

溶液B（DNA结合液）：2.5-6M的盐酸胍或者异硫氰酸胍，20%-40%（v/v）异丙醇或者是无水乙醇，5mM-20mM EDTA，pH4.5-6.5；

溶液C（DNA洗涤液）：70%-80%（v/v）的无水乙醇，pH4.5-6.5；

溶液D（DNA洗脱液）：5-50μg/mL的RNA酶水溶液，用1M NaOH溶液将pH调到7.0-8.5。

还包括研磨器：该研磨器可以为电动组织研磨器或者小型的手提电钻其转速800-12000rpm，配有长度为40-80mm，直径3-7mm的锥形研磨杵。

上述试剂盒的优选配方

溶液A：50mM Tris-HCl、50mM EDTA、3%SDS、2M NaCl、1%的β-巯基乙醇，pH8.0；

溶液B：4M的盐酸胍、20%异丙醇、10mM EDTA、pH5.0的0.2M的乙酸-乙酸钠缓冲液；

溶液C：70%的无水乙醇、pH5.0的0.2M的乙酸-乙酸钠缓冲液

溶液D：20μg/mL的RNA酶水溶液，用1M NaOH溶液将pH调到8.0。研磨器：转速8000rpm、配有长度为70mm，直径5mm的锥形研磨杵。

本发明的主要原理：研磨器在高速条件下产生的剪切力不仅能将丝状真菌的细胞壁破碎，同时研磨杵与离心管壁的摩擦作用而产生较高的温度（50℃-70℃），有利于SDS裂解细胞。在研磨器、高温和SDS的相互作用下，丝状真菌的基因组DNA释放出来。在2M NaCl溶液中DNA的溶解度最大。EDTA是金属螯合剂能抑制DNA酶的活性，防止DNA的降解。β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除。DNA结合液提供一个高盐低pH值的环境，在这种条件下，DNA可以与硅胶柱可逆结合。洗涤液是70%乙醇可以对硅胶柱脱盐。DNA在pH7.0-8.5的低盐溶液中，具有最大洗脱效率。洗脱液是含有RNA酶的碱性水溶液，能将硅胶柱上DNA洗脱下来。

本发明的另一方面是使用该试剂盒提取基因组DNA的方法，包括以下步骤：

1、样品的预处理

（1）取1.5mL的锥底离心管，加入0.1mg-100mg组织样品或者10⁶-10⁹细胞样品；

（2）向（1）中加入50μL-100μL的溶液A；

（3）开动研磨器研磨样品30s-5min；

2、样品的过柱纯化