[发明专利]基于焦磷酸测序的检测结核分枝杆菌已胺丁醇耐药性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测结核分枝杆菌耐药性的方法，具体是一种基于焦磷酸测序的检测结核分枝杆菌已胺丁醇耐药性的方法。 

背景技术

结核病是严重危害人类健康的慢性传染病，是目前传染病中威胁人类健康的头号杀手。耐药结核菌株的产生和播散，尤其是耐多药菌株的出现，已成为新世纪结核病控制的三大难题之一。快速准确的耐多药结核病的检测对于早期发现、阻断耐药结核病的传播，规范指导用药，提高耐药结核病的治愈率具有非常重要的意义。 

结核分枝杆菌生长缓慢,传统用于结核分枝杆菌耐药性的检测方法主要以培养为基础的绝对浓度法或比例法，因不能及时确定药物的耐药性,可导致多重耐药发生,以及耐药结核的传播。已报道的药敏基因检测方法如传统测序法、单链构象多态性分析法、RNA/RNA错配法、线性探针杂交法、异源双链形成分析法和基因芯片法，多数存在检测时间长、检测过程繁琐且不能精确确定突变位置及突变类型等缺点。 

焦磷酸测序技术是一种新型DNA测序技术，与作为分子药敏金标准的Sanger测序法相比，无需对整个基因进行测定，只需对特定短片段进行测序即可检测到所有类型的突变，赵锦荣等用此法在结核菌利福平耐药决定区突变检测中取得良好的效果,目前用焦磷酸测序技术检测已胺丁醇耐药性还没有相关报道。 

药物乙胺丁醇(EMB)是具有广谱抗分支杆菌活性的一线抗结核合成药物，被广泛应用于结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌和堪萨斯分枝杆菌等引起的结核的治疗，具有比异烟肼更广的抗菌谱。embB基因全长约3246bp,编码阿拉伯糖基转移酶,embB基因突变使阿拉伯糖基转移酶的结构发生改变,影响其与EMB的相互作用,使EMB失去作用靶分子或结合力降低而失去作用,导致耐EMB的产生。 

研究表明结核EMB耐药主要由embB基因306位点(embB306)的突变引起。长期以来embB306突变一直被视为结核分枝杆菌耐已胺丁醇(EMB)的分子诊断标记。但是，最近研究发现，embB306突变并不特异性地引起结核分枝杆菌EMB耐药性，而是容易产生对任何药物的耐药性，检测embB306基因突变可作为耐多药结核病的标志。 

发明内容

本发明的目的是提供一种基于焦磷酸测序的检测结核分枝杆菌已胺丁醇耐药性的方法，通过检测其embB基因306位点的变异，判断结核杆菌耐多药性，以克服现有技术的不足，并有助于实现对感染MDR.TB以及其他多耐药结核分枝杆菌患者的早发现、早诊断和早治疗。 

本发明的技术构思如下： 

由于embB基因的突变主要集中于306位点，本发明主要针对乙胺丁醇耐药基因306位点进行焦磷酸测序检测。 

先对embB基因进行PCR扩增，再对PCR扩增产物进行焦磷酸测序，判断embB基因是否具有突变；其中焦磷酸测序采用序列分析模式（Sequence Analysis，SQA）SQA模式、核苷酸加样顺序为AGCT。 

本发明的主要原理为: 

焦磷酸测序技术 

1)焦磷酸测序（Pyrosequencing）技术是全新的一种DNA序列分析技术，可以快速、准确地测定一段较短的目标片段。该技术无须进行电泳，DNA片段也无须荧光标记，操作极为简便。 

2)焦磷酸测序技术是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，基本原理如下：将1个特异性的测序引物和单链DNA模板结合，然后加入酶混合物（包括DNA Polymerase、ATP Sulfurylase、Luciferase和Apyrase）和底物混合物（包括APS和Luciferin）。向反应体系中加入1种dNTP，如果它刚好能和DNA模板的下一个碱基配对，则会在DNA聚合酶的作用下，添加到测序引物的3’末端，同时释放出摩尔数的焦磷酸基团。在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS结合形成ATP；在荧光素酶的催化下，生成的ATP又可以和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光。通过CCD光学系统即可获得一个特异的检测峰，峰值的高低则和相匹配的碱基数成正比。反应体系中剩余的dNTP和残留的少量ATP在Apyrase的作用下发生降解。加入另一种dNTP，使第2～4步反应重复进行，根据获得的峰值图即可读取准确的DNA序列信息。每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比。然后加入下一种dNTP，继续DNA链的合成。