[发明专利]基于焦磷酸测序的检测结核分枝杆菌已胺丁醇耐药性的方法

权利要求书

1.基于焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌已胺丁醇耐药性的方法，其特征在于包括以下顺序步骤：

步骤1，对embB基因进行PCR扩增；包括针对embB基因306位点设计PCR扩增引物，以标本结核杆菌DNA提取物为模板，对embB基因进行PCR扩增，

扩增使用的PCR引物在embB基因306位点序列是高度保守和唯一的，扩增结核分枝杆菌embB基因的DNA片段长度为165bp，包含embB基因306位点序列:atg

所用的扩增embB基因的PCR引物及其序列如下：

F:CGTGGTGATATTCGGCTTCCT

R:AGGTTGTAATACCAGCCGAAGG

其中F引物5端用生物素标记；F为PCR上游引物；R为PCR下游引物。

步骤2，对PCR扩增产物进行焦磷酸测序，判断embB基因306位点是否具有突变；其中焦磷酸测序采用SQA模式、核苷酸加样顺序为AGCT；

所述焦磷酸测序检测步骤具体如下

（1）PCR产物固定：在PCR板中放入40μL的PCR扩增产物，再分别加入36μL的结合缓冲液和4μL链亲和素包被的磁珠；将PCR板放在涡旋振荡器上常温振荡20分钟，使PCR产物固定在磁珠上；

（2）单链模板的纯化：打开真空泵，将真空样品转移器移到PCR板中，抓取结合PCR产物的磁珠，检查是否大部分磁珠都被吸附在了真空样品转移器上；再将真空样品转移器放入70%乙醇中轻微振荡5秒，然后移到变性缓冲液中抽吸5秒，使DNA变性以得到纯化的单链DNA模板，最后移到洗涤缓冲液中清洗5-10秒，洗涤未固定的单链DNA，从而得到作为测序模板的单链DNA；

（3）引物杂交：先在焦磷酸测序微孔板各孔中加入退火缓冲液50μL，再加入具有表1所示序列测序引物；测序引物的最低要求浓度为1μmol/L，最高浓度为0.2mmol/L；再将真空样品转移器从PCR板移入焦磷酸测序微孔板，关闭真空泵，将已纯化好的单链DNA模板与序列测序物引物混和，在80℃下变性2分钟，然后冷却至室温，使引物与模板退火杂交；

测序引物的序列如下所示：

GTGGTCGGCGACTCG

（4）焦磷酸测序：依次在测序仪试剂仓中加入酶、底物和4种dNTPs，选用SQA检测模式、以A、G、C、T顺序循环加样16次的碱基加入顺序进行测序反应；通过CCD光学系统对每次加样后产物进行检测，以获得特异的检测峰，根据获得的峰值图即可读取准确的DNA序列信息；

（5）将焦磷酸测序结果与结核分枝杆菌标准株的embB基因306位点序列相比较，即可准确的判断出结核分枝杆菌embB基因306位点是否发生耐药突变，embB306突变被视为结核分枝杆菌耐已胺丁醇(EMB)和耐多药结核病的分子诊断标记，进一步判断检测结核分枝杆菌具有耐已胺丁醇(EMB)和耐多药性。

2.如权利要求1所述的基于焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药性的方法，其特征在于在50μL反应体系中，其中所述PCR引物的浓度为50nmol/L。

3.如权利要求1所述的基于焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药性的方法，其特征在于所述的扩增反应过程包括下列顺序步骤：

步骤1：在95℃下进行预热2分钟；

步骤2：在95℃下保持15秒进行变性、59℃下保持15秒进行退火、72℃下保持15秒进行扩增和延伸，循环退火过程36次；

步骤3：在72℃下保持7分钟。