[发明专利]一种利用高速逆流色谱分离纯化制备哈巴俄苷和斩龙剑苷A的方法

说明书

（一）技术领域

本发明属于天然药物分离领域，涉及一种分离纯化哈巴俄苷和斩龙剑苷A的方法，尤其涉及一种利用高速逆流色谱分离纯化高纯度哈巴俄苷和斩龙剑苷A的方法。

（二）背景技术

玄参为玄参科植物玄参Scrophularia ningpoensis Hemsl的干燥根。中医认为玄参味甘、苦、咸，其性微寒，具有滋阴凉血、泻火解毒等功效，一般用于热病烦躁、发斑、夜寐不宁，自汗盗汗，喉咙肿痛等症，为临床常用中药。

现代医学表明，玄参中含萜类、苷类、生物碱等成分，具有抗炎、抗肿瘤、保肝作用。

哈巴俄苷为环烯醚萜类物质，分子式C₂₀H₂₂O₈，淡黄色粉末，熔点189-190℃，分子结构式如下：

斩龙剑苷A为无色粉末，熔点110-112℃，分子式C₂₁H₂₈O₁₂，分子结构式如下：

现有技术一般采用普通色谱柱法、重结晶等传统的分离方法分离植物中的有效单体，不仅费时费力、污染环境，且所有固定相对样品有不可逆性吸附作用。高速逆流色谱（HSCCC）是近年来发展起来的一种连续的无需固体支撑物的高效、快速的液液分配色谱分离技术，具有分离量大、样品无损失、回收率高、分离环境缓和、节约溶剂等特点，已经广泛应用于生物、医药、环保等领域化学物质的制备分离和纯化。

（三）发明内容：

本发明的目的是提供高速逆流色谱制备哈巴俄苷和斩龙剑苷A的方法，以克服现有技术中存在的上述问题。

本发明通过以下技术方案实现：

一种利用高速逆流色谱分离纯化制备哈巴俄苷和斩龙剑苷A的方法，由粗提物的制备和粗提物的分离纯化两部分组成，其特征在于粗提物的分离纯化应用高速逆流色谱来进行，具体的，所述方法包括以下步骤：

（1）将玄参药材粉碎成粗粉，加入体积分数10%-95%的乙醇溶剂中，加热至回流提取1-3次，提取液趁热过滤，冷却，滤液减压除去溶剂，得到乙醇提取物；

（2）哈巴俄苷、斩龙剑苷A的富集：将乙醇提取物加入填充有大孔吸附树脂的色谱柱中，用水和甲醇或乙醇的混合溶剂（优选水和乙醇的混合溶剂）梯度洗脱，收集含有哈巴俄苷、斩龙剑苷A的洗脱液，减压除去溶剂，干燥、得到哈巴俄苷、斩龙剑苷A混合粗提物；

（3）哈巴俄苷、斩龙剑苷A的纯化：将哈巴俄苷、斩龙剑苷A混合粗提物进行高速逆流色谱分离，以体积比为1-5:5-10:1-10的溶剂A、溶剂B、溶剂C组成高速逆流溶剂体系，所述溶剂A为甲醇、乙醇、正丁醇或异丁醇，所述溶剂B为乙酸乙酯、乙酸丙酯或乙酸正丁酯，所述溶剂C为水，将所述高速逆流溶剂体系混合充分后静置，按上下两相分开，取上相为固定相，下相为流动相，将固定相充满高速逆流色谱仪的多层线圈分离柱，设定高速逆流色谱仪，在500～1000r/min转速（优选800r/min转速）下，以0.5～5ml/min（优选2ml/min）的流速注入流动相，以波长190-380nm（优选210～254nm）的紫外检测器检测，当明显有流动相流出时，取哈巴俄苷、斩龙剑苷A混合粗提物，用上相、下相体积比1：1的混合溶剂溶解后进样，根据紫外检测器光谱图的峰形分别收集对应流出液，浓缩、干燥，分别制得哈巴俄苷、斩龙剑苷A。

所述步骤（1）中，乙醇溶剂的体积用量以粗粉的质量计为3～10L/kg，每次回流提取的时间为30-60min，提取次数为1-3次。

所述步骤（1）中，所述乙醇溶剂优选体积分数50%的乙醇溶剂。

所述步骤（2）中，所述大孔吸附树脂为非极性、弱极性或中极性的大孔吸附树脂，优选D101、AB-8、DM301等大孔吸附树脂，更优选AB-8大孔吸附树脂。

所述步骤（2）中，所述梯度洗脱条件为先用2-6倍柱体积的水洗脱，再用2-6倍柱体积的体积分数10%-30%乙醇或甲醇的水溶液（优选乙醇水溶液）洗脱，再用2-6倍柱体积的体积分数30%-50%乙醇或甲醇水溶液（优选乙醇水溶液）洗脱，再用2-6倍柱体积的体积分数40%-70%乙醇或甲醇水溶液（优选乙醇水溶液）洗脱，再用2-6倍柱体积的体积分数60%-95%乙醇或甲醇水溶液（优选乙醇水溶液）洗脱。

进一步，所述梯度洗脱优选为以下之一：