[发明专利]一种基于SSR与毛细管电泳技术鉴定甘蔗种质资源的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种利用SSR和毛细管电泳技术鉴定甘蔗种质资源的高通量检测方法。

背景技术

我国是世界上古老的甘蔗种植国家之一，历代甘蔗栽培品种类型很多。近年来，中国又引进、选育了适应于各种生态类型蔗区推广的甘蔗品种120多个。但当前甘蔗栽培品种遗传基础狭窄，品种的形态、农艺性状等生物学特性差异不大，如何鉴定甘蔗栽培品种及其杂交后代已成为当今甘蔗科研工作的重难点之一。

在DNA分子技术方法广泛应用之前，人们主要是借助形态和农艺性状、细胞核型分析、同工酶标记、染色体分析技术等实验方法，对甘蔗栽培品种进行鉴定，但这些方法受环境、有限的标记数量等因素制约，不能得到广泛推广。DNA分子标记技术是DNA水平上遗传多样性的直接反映，具有数量多、稳定好、无表型效应，不受环境影响等优点。

DNA指纹技术是指能够反映生物个体或种群间基因组中DNA位点差异的一种分子生物学技术。目前DNA分子标记已广泛应用于甘蔗栽培品种指纹图谱构建、遗传分析、基因定位和分子标记辅助选择等方面。与其它分子标记相比，SSR分子标记技术具有多态性丰富、共显性遗传方式、分析方法简单、重复性好等优点。目前，对SSR标记技术的PCR产物检测方法主要有荧光标记引物测序法、同位素标记引物的聚丙烯酰胺电泳法, 以及银染聚丙烯酰胺PAGE（polyacrylamide gel electrophoresis）方法。PAGE是目前最常用的检测方法，但其因需要银染，使得检测过程变得复杂，且不能准确读出片段大小，只能粗略的估计。

毛细管电泳（capillary electrophoresis, CE）也叫高效毛细管电泳（HPCE）。是20世纪80年代后期在全球范围内迅速崛起的一种分离分析技术。毛细管凝胶电泳和普通电泳相比，具有高灵敏度、高分辨率、高速度、样品少等优点；因此，CE被逐步应用于检测分子标记技术的PCR扩增产物。

发明内容

本发明的目的是解决甘蔗种质资源鉴定难的问题，提供一种高通量、操作简单、结果准确可靠的甘蔗种子资源的鉴定方法。而将毛细管电泳技术与SSR分子标记技术结合，能够为甘蔗亲属关系的鉴定、品种鉴定、种子真实性鉴定以及种子纯度鉴定提供有力的支持。

本发明提供的甘蔗种质资源鉴定方法，其步骤为：提取甘蔗新鲜嫩叶DNA，利用12对SSR荧光引物与毛细管电泳技术相结合构建52个在中国广泛种植的甘蔗品种DNA指纹数据库，将待测品种或品系DNA指纹数据与已构建的甘蔗DNA指纹数据库中的数据进行对比分析，判断待测品种或品系的种类名称。

作为本发明的进一步限定，所述12对SSR荧光引物为筛选得到的核心引物，其引物信息如下表：

作为本发明的进一步限定，所述DNA提取包括一些步骤：将甘蔗嫩叶于液氮研磨成粉末状，加入1.2 ml 65℃预热的SDS提取液，摇匀，65℃水浴45 min；加入200 μl KAc(5 mol/L，pH4.8)，混匀后，冰浴15 min；4℃，10000 rpm 离心15 min，取1 ml上清液，加入等体积氯仿混匀；4℃，12000 rpm 离心7 min，取上清液，加1/10体积的NaAc (3 mol/L，pH5.2) 和2倍体积的预冷无水乙醇，冰浴20 min；4℃，10000 rpm 离心10 min，弃上清，用70%酒精洗涤2次，晾干沉淀；加入200 μl已灭菌的TE溶液（pH8.0），溶解沉淀，即得DNA 溶液，置于-20℃保存备用；

作为本发明的进一步限定，所述PCR扩增的扩增程序为：首先95℃预变性5 min；随后的30个循环为：94℃变性30 sec，退火30 sec（不同引物的具体温度表1），72℃延伸30 sec；最后72℃下延伸2 min。

作为本发明的进一步限定，所述毛细管电泳分析方法为将所得到的PCR产物稀释100倍后，在 BECKMAN COULTER CEQ 8000遗传分析系统仪上利用毛细管电泳法检测，每个CE样品中含有1 μl PCR产物、0.2 μl Genescan-400分子量标准品和20 μl SLS溶液。在毛细管凝胶电泳过程中，PCR产物与Genescan-400分子量标准品的荧光信号均由基因分析仪自动保存。