[发明专利]一种检测大白菜黄萎病病原菌的实时荧光定量PCR方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测大白菜黄萎病病原菌的实时荧光定量PCR方法。

背景技术

黄萎病多是由黄萎轮枝菌属的大丽轮枝菌、黑白轮枝菌从根部侵染引起的土传维管束病害，该病的寄主范围广，存在不同的生理小种，其微菌核在土壤中存活时间长，具有高度抵抗不良环境的能力，防治难度大，目前已对棉花、番茄、辣椒、茄子等多种作物造成严重影响，被称为植物的“癌症”。

大白菜属十字花科芸薹属，是我国栽培面积最大的蔬菜作物，目前已逐渐成为世界性的蔬菜作物。据农业部统计，我国大白菜年种植面积近4000万亩，占蔬菜总播种面积的15%左右，可见大白菜在我国菜篮子工程中举足轻重。目前对大白菜病害的研究多集中在病毒病、软腐病、霜霉病三大病害上，而近年来在北京和一些大规模大白菜生产基地发生了十分严重的黄萎病，并呈逐年上升趋势。研究表明该病害是由大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)引起的白菜黄萎病，此病害在包心期开始发病，其症状表现为叶片枯黄，植株矮化，维管束变褐变黑，严重时则会导致白菜绝产。

传统的寄主抗病性鉴定一般是采用温室人工接种鉴定和田间病圃鉴定，但易受环境条件、人为因素和非目标病原菌的影响，给鉴定结果带来一定误差。黄萎病发生时，最早出现的症状是基部叶片变黄，进一步发展是叶片出现枯斑，生长迟缓，萎蔫，叶片脱落，最后维管束系统变褐色。黄萎病人工接种抗病性鉴定，一般在三叶期，采用蘸根接种法，由于白菜幼苗木质化水平低，接种黄萎病菌后缓苗慢，叶片也容易出现黄化现象，给黄萎病症状的区分带来很大的困难。因此，要在早期对白菜育种材料的黄萎病抗性进行鉴定，必须建立一种简单、灵敏、准确的病原菌检测技术。

在病原菌检测方法中，实时荧光定量PCR技术具有独特的优势，已广泛运用于植物病原菌及植物病毒的检测。该方法利用特异性引物来扩增植物材料中目标物的DNA，能较为准确地检测不同组织、不同材料中病原菌的相对含量。Gayoso等应用实时荧光定量PCR技术检测了被大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)侵染的辣椒和番茄中的病原菌含量,发现感病植株中病菌的相对含量高于抗病植株,并且不同基因型的植株所表现病症的严重程度与植株体内病原菌的相对含量有相关性。Dan等利用马铃薯植株中病原菌DNA含量的多少来评价植株对黄萎病的抗感水平。传统病原菌含量检测通常采用菌落计数法,例如NP-10平板检测法，但是该方法从病株中分离病原菌大概需要耗时两周，因此不能用于大批量的检测实践；其次该方法不能有效的区分大丽轮枝菌的近缘种。与传统病原菌检测方法相比，qRT-PCR技术具有灵敏、快速、特异等优点。具体优点如下：

1.检测的特异性。可有效的区分大丽轮枝菌的近缘种。真菌在rDNA-ITS区段在种内具有高度的保守性，在属间或种间又存在着广泛的多态性，已被广泛用于病菌的分类鉴定、监测及病害诊断等。

2.检测的灵敏性。检测的最低值可达到5×10^-3ng·μL^-1。

3.检测的快速性。从样品准备到DNA提取再到利用real-time PCR技术获得病原菌含量的总时间不超过8小时。

4.检测的高通量性。利用罗氏公司LightCycler480PCR仪的384模块，50分钟内即可实现384个样本病原菌的准确定量。

5.检测材料生长时间的广泛性。该技术能够检测从白菜幼苗到成株的任意时期的黄萎病原菌感染情况。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测大白菜黄萎病病原菌的实时荧光定量PCR方法。

本发明提供的一对引物，由SEQ ID No.1所示的DNA分子和SEQ ID No.2所示的DNA分子组成。

一种定量检测大白菜黄萎病病原菌的试剂盒也属于本发明的保护范围，该试剂盒包含上述引物对。

上述试剂盒中，所述大白菜黄萎病病原菌为大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)，具体为大白菜黄萎病病原菌BCHW10-2。

一种定量检测大白菜黄萎病病原菌的实时荧光定量PCR方法也属于本发明的保护范围，该方法包括如下步骤：

（1）将提取的黄萎病病原菌标准品的DNA进行10倍梯度稀释，得到梯度稀释的黄萎病病原菌的DNA，以其为模板，以SEQ ID No.1所示的DNA分子和SEQ ID No.2所示的DNA分子为引物进行实时荧光定量PCR扩增，以模板浓度的Log值为横坐标，以每个反应孔的荧光值达到所设阈值经历的循环数为纵坐标，制作标准曲线，得到标准曲线公式1；