[发明专利]一种检测大白菜黄萎病病原菌的实时荧光定量PCR方法

权利要求书

1.一对引物，由SEQ ID No.1所示的DNA分子和SEQ ID No.2所示的DNA分子组成。

2.一种定量检测大白菜黄萎病病原菌的试剂盒，该试剂盒包含权利要求1所述的引物。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述大白菜黄萎病病原菌为大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)，具体为大白菜黄萎病病原菌BCHW10-2。

4.一种定量检测大白菜黄萎病病原菌的实时荧光定量PCR方法，该方法包括如下步骤：

（1）将提取的黄萎病病原菌标准品的DNA进行10倍梯度稀释，得到梯度稀释的黄萎病病原菌的DNA，以其为模板，以SEQ ID No.1所示的DNA分子和SEQ ID No.2所示的DNA分子为引物进行实时荧光定量PCR扩增，以模板浓度的Log值为横坐标，以每个反应孔的荧光值达到所设阈值经历的循环数为纵坐标，制作标准曲线，得到标准曲线公式1；

（2）将提取的未染任何病菌的大白菜的根、茎或叶组织的基因组DNA进行两倍梯度稀释，得到梯度稀释的样品的DNA，以其为模板，以扩增GAPDH的引物为引物进行实时荧光定量PCR扩增，以模板浓度的Log值为横坐标，以每个反应孔的荧光值达到所设阈值经历的循环数为纵坐标，制作标准曲线，得到标准曲线公式2；

（3）以待检大白菜的根、茎或叶组织的基因组DNA为模板，以SEQ ID No.1所示的DNA分子和SEQ ID No.2所示的DNA分子为引物进行实时荧光定量PCR扩增，得到循环数CP1，将CP1值带入标准曲线公式1，得到待检大白菜中大白菜黄萎病病原菌的绝对含量；以待检大白菜的根、茎或叶组织的基因组DNA为模板，以GAPDH引物为引物进行实时荧光定量PCR扩增，得到循环数CP2，将CP2值带入标准曲线公式2，得到待检样品的GAPDH绝对含量；待检大白菜内黄萎病病原菌的相对含量=待检大白菜中大白菜黄萎病病原菌的绝对含量/GAPDH绝对含量。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述实时荧光定量PCR的PCR反应体系如下：实时荧光定量PCR扩增缓冲液(2×)5μL，浓度为10μM的引物各1μL，模板3μL；

所述实时荧光定量PCR扩增缓冲液(2×)的商品名称为SYBR Green I Master(2×)，来自480cSYBR Green I Master试剂盒，该试剂盒购自罗氏公司，产品目录号为04887352001；

PCR程序如下：预变性95℃，5min；95℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸50s，40个循环；

熔解曲线制作程序：95℃5s，65℃60s，每10s温度递升0.5℃到97℃结束,连续检测荧光强度。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述步骤（1）中提取的黄萎病病原菌BCHW10-2的DNA浓度为50ng·μL^-1；

所述步骤（2）中提取的大白菜的根、茎或叶组织的基因组DNA浓度为200ng·μL^-1；

所述标准曲线公式1为Y=-3.553X+10.04；

所述标准曲线公式2为Y=-3.193X+23.22。

7.根据权利要求4-6任一所述的方法，其特征在于：所述黄萎病病原菌为大白菜黄萎病病原菌BCHW10-2。

8.权利要求1所述的引物对在检测大白菜中的大白菜黄萎病病原菌中的应用；

或，

权利要求1所述的引物对在检测大白菜是否感染大白菜黄萎病病原菌中的应用。

9.权利要求2所述的试剂盒在检测大白菜中的大白菜黄萎病病原菌的应用；

或，

权利要求2所述的试剂盒在检测大白菜是否感染大白菜黄萎病病原菌中的应用。

10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于：所述大白菜黄萎病病原菌为大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)，具体为大白菜黄萎病病原菌BCHW10-2。