[发明专利]一种胃液中lncRNA的提取与检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种lncRNA的提取与检测方法，尤其涉及一种胃液中lncRNA的提取与检测方法。

背景技术

人体中编码蛋白质的基因大约有2～3万个，仅占人类基因组的2%，其余98%不编码蛋白质的基因组DNA最初被认为是没有功能的，是生物体中的垃圾，通常被称为“垃圾DNA”(junk DNA)。但目前的研究表明，这些垃圾DNA大多可转录产生非编码RNA(noncoding RNA，ncRNA)，随着高通量全基因组测序技术的普遍应用，人们惊奇地发现哺乳动物细胞中约98%的转录物为ncRNA。在这些ncRNA分子中有包括目前人们所熟知的“看家(housekeeping)”ncRNA(如tRNA和rRNA等)、小ncRNA(如microRNA和piRNA等)，而更多的则是尚待深入研究的长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)分子。

lncRNA是指一类转录本长度大于200个核苷酸(nucleotide，nt)并且不具备编码蛋白质功能的RNA分子。这类分子一般具有高度保守的序列元件、特定的空间二级结构、剪切形式和亚细胞定位，特别是它们中的许多成员被发现具有组织或细胞特异性。这种保守性和特异性决定了lncRNA具有广泛的生物学功能，涉及染色体结构动态变化、端粒维持、亚细胞结构组成、基因组印迹、剂量补偿效应等生命过程。正因为如此，lncRNA不能再被认为是基因组转录的“噪音”和RNA聚合酶II转录的副产物，而是一类具有重要生物学功能的新型ncRNA分子。

对于ncRNA结构特征和生物学功能的研究，离不开各类体液ncRNA的提取、RNA质量鉴定及其检测。目前胃液中ncRNA的提取与检测方法如一申请号201010606089.8(公告号为CN102127601A)的中国发明专利申请《一种胃液中miRNA的检测方法》就公开了操作步骤，具体包括胃液抽取和氢氧化钠溶液中和、胰蛋白酶消化、加Trizol试剂混匀静置、RNA释放、氯仿提取、异丙醇沉淀、乙醇洗涤、RNA逆转录和PCR检测等步骤。

上述方法解决了胃液中酸度、多糖和粘蛋白等对miRNA提取的干扰问题。然而，由于Trizol试剂只适合组织样本总RNA的提取，况且miRNA分子远小于lncRNA分子，前者只有20多个nt，假如采用类似提取miRNA的方法用于胃液中lncRNA的提取则明显存在操作步骤复杂、RNA产率低的缺陷。同时室温下lncRNA性质较不稳定，而胃液中又存在相当数量的核酸酶，所以lncRNA是极易在提取中降解。以上因素均能严重影响胃液lncRNA的质量。

此外，胃液中lncRNA丰度低，对胃液lncRNA的提取和检测难度较大，截至目前仍没有完善的提取、检测胃液中lncRNA技术方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术现状而提供一种胃液中lncRNA的提取与检测方法，该方法能去除胃液中多糖和粘蛋白等杂质的干扰，实现了胃液中lncRNA高质量、高含量提取，并对提取的lncRNA进行荧光定量RT-PCR检测。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：该胃液中lncRNA的提取方法，包括如下步骤：

(1)采用RNA抽提试剂提取人胃液总RNA，用逆转录试剂对RNA提取液进行逆转录反应得到cDNA；

(2)对步骤(1)的cDNA溶液进行PCR扩增反应，再用荧光定量PCR仪检测扩增；

其特征在于：步骤(1)中采用抽提剂Trizol LS对胃液进行RNA的提取，并且在步骤(2)中通过lncRNA特异性扩增上下游引物或GAPDH扩增上下游引物对cDNA溶液进行PCR扩增反应。

其中，所述步骤(1)的具体步骤为：

a、胃液抽取：用胃管抽取空腹人胃液3～6ml，放入离心管中，室温下3000rpm离心3分钟，将上清转移到另一无RNA酶离心管中，至于冰上；

b、胃液预处理：取步骤a的胃液250～350μl置于2ml无RNA酶离心管中，加入3倍体积的Trizol LS试剂，漩涡振荡10秒，室温静置5分钟，4℃下，12000rpm离心10分钟，将上层液体转移到一新的无RNA酶离心管中；

c、三氯甲烷提取：在步骤b的上清液中加入0.2～0.3ml三氯甲烷，漩涡振荡10秒，室温下静置5分钟，4℃下，12000rpm离心15分钟，吸取上层水相移入新的无RNA酶离心管中；