[发明专利]一种胃液中lncRNA的提取与检测方法

权利要求书

1.一种胃液中lncRNA的提取与检测方法，包括如下步骤：

(1)采用RNA抽提试剂提取人胃液总RNA，用逆转录试剂对RNA提取液进行逆转录反应得到cDNA；

(2)对步骤(1)的cDNA溶液进行PCR扩增反应，再用荧光定量PCR仪检测扩增；

其特征在于：步骤(1)中采用抽提剂Trizol LS对胃液进行RNA的提取，并且在步骤(2)中通过lncRNA特异性扩增上下游引物或GAPDH扩增上下游引物对cDNA溶液进行PCR扩增反应。

2.如权利要求1所述的一种胃液中lncRNA的提取与检测方法，其特征在于：所述步骤(1)的具体步骤为：

a、胃液抽取：用胃管抽取空腹人胃液3～6ml，放入离心管中，室温下3000rpm离心3分钟，将上清转移到另一无RNA酶离心管中，至于冰上；

b、胃液预处理：取步骤a的胃液250～350μl置于2ml无RNA酶离心管中，加入3倍体积的Trizol LS试剂，漩涡振荡10秒，室温静置5分钟，4℃下，12000rpm离心10分钟，将上层液体转移到一新的无RNA酶离心管中；

c、三氯甲烷提取：在步骤b的上清液中加入0.2～0.3ml三氯甲烷，漩涡振荡10秒，室温下静置5分钟，4℃下，12000rpm离心15分钟，吸取上层水相移入新的无RNA酶离心管中；

d、异丙醇沉淀：加入与步骤c中上层水相等体积的异丙醇，混匀后，4℃条件下静置20分钟，然后4℃下12000rpm离心10分钟，弃上清得沉淀；

e、乙醇洗涤：在步骤d的沉淀中加入质量分数为75%的乙醇1ml，颠倒数次，4℃下12000rpm离心5分钟，弃上清；

f、干燥RNA：上一步弃上清后，再次4℃下12000rpm离心2分钟；弃上清，室温下干燥1～2分钟，加10μl无RNA酶水溶解，得到RNA提取液，-80℃保存备用；

g、RNA逆转录：用逆转录试剂对步骤f的RNA提取液进行逆转录反应得到cDNA溶液，置-20℃保存备用；

h、PCR检测：对步骤g的cDNA溶液进行PCR扩增反应，扩增上下游引物为lncRNA特异性扩增上下游引物或GAPDH扩增上下游引物，再用荧光定量PCR仪检测。

3.如权利要求1所述的一种胃液中lncRNA的提取与检测方法，其特征在于：所述步骤(2)中lncRNA特异性扩增上下游引物分别为RMRP扩增上下游引物。

4.如权利要求1所述的一种胃液中lncRNA的提取与检测方法，其特征在于：所述步骤(2)中lncRNA特异性扩增上下游引物分别为AA174084扩增上下游引物。

5.如权利要求1所述的一种胃液中lncRNA的提取与检测方法，其特征在于：所述步骤(2)中GAPDH特异性扩增上游引物为：5’ACCCACTCCTCCACCTTTGAC3’；和GAPDH特异性扩增下游引物为：5’TGTTGCTGTAGCCAAATTCGTT3’。

6.如权利要求3所述的一种胃液中lncRNA的提取与检测方法，其特征在于：所述RMRP扩增上游引物为：5’ACTCCAAAGTCCGCCAAGA3’；和RMRP扩增下游引物为：5’TGCGTAACTAGAGGGAGCTGAC3’。

7.如权利要求4所述的一种胃液中lncRNA的提取与检测方法，其特征在于：所述AA174084扩增上游引物为：5’CTGGTTCTTCATCCCTGCTATG3’；和AA174084扩增下游引物为：5’CCTGCTCCTCTTTGTGTTCTCT3’。

8.如权利要求1所述的一种胃液中lncRNA的提取与检测方法，其特征在于：所述步骤(2)的PCR扩增反应条件为：95℃预变性5分钟；然后94℃变性15秒，55℃退火30秒，70℃延伸30秒，共45个循环。

9.如权利要求1所述的一种胃液中lncRNA的提取与检测方法，其特征在于：所述步骤(1)中胃液与抽提剂Trizol LS的加入比例为1：2.5～3.5。