[发明专利]一种J亚群禽白血病免疫胶体金抗体检测试纸条

说明书

技术领域

本发明涉及预防兽医学检验领域，具体涉及了一种J亚群禽白血病免疫胶体金抗体检测试纸条。

背景技术

J亚群禽白血病是由J亚群禽白血病病毒（ALV-J）引起的一种肿瘤性疾病，临床上主要以髓细胞性白血病多见，研究发现J亚群禽白血病毒还能诱发淋巴细胞性白血病、成髓细胞性白血病、成红细胞性白血病等多种肿瘤性疾病。J亚群禽白血病已经从最初的感染肉鸡到现在的感染蛋鸡、火鸡及地方鸡品种。近几年，禽白血病的流行呈现高感染率、高发病率，早期感染普遍、发病日龄明显提前，混合感染促使病毒重组频率增高，宿主范围扩展、肿瘤趋于多样化等新特点。目前，与J亚群白血病密切相关的血管瘤病在蛋种鸡群及商品蛋鸡群中的爆发，给养禽业造成了巨大的损失。基于其病毒特性，一直未有行之有效的疫苗、药物防治此病。国外通过净化控制本病的发生。由于净化周期长、成本高，在我国目前还未能有效实施，只能通过淘汰感染鸡只进行大群净化，快速精准检测J亚群禽白血病的感染对于净化控制J亚群禽白血病具有极其重要的意义。

（1）ALV-J表面蛋白（SU）的生物学功能

ALV-J属于反转录病毒。病毒囊膜蛋白可分为由gp85基因编码的表面蛋白（surface protein,SU）和gp37基因编码的跨膜蛋白（transm-embrane protein，TM），二者在一起形成二聚体，病毒囊膜蛋白决定亚群的特异性。SU含有病毒---受体决定簇，负责识别靶细胞膜上的特异性受体，TM负责介导病毒与细胞的融合过程。SU刺激机体产生的中和抗体具有亚群特异性。ALV-J表面蛋白的核酸序列与其它ALV亚群同源性只有40%。ALV-J囊膜蛋白的SU可特异性识别J亚群禽白血病毒刺激机体产生的中和抗体，对于J亚群禽白血病的诊断具有重要意义。

（2）J亚群禽白血病诊断方法研究现状

对于J亚群禽白血病的诊断方法国内外都有过许多报道，主要为病毒分离与鉴定、免疫学检测方法、核酸分子检测方法。病毒的分离与鉴定耗费时间过长且只适用于实验室诊断；免疫学检测方法如间接免疫荧光、ELISA方法等都需要一定的专业知识和设备，不适用于养殖场的现场检测；核酸分子检测方法如PCR等容易受到假阳性、假阴性及抗原变异的干扰，且上述检测方法均建立在实验室基础上并需要专业操作人员操作。因此研制快速精准并易于操作携带的J亚群禽白血病免疫胶体金抗体检测试纸条，对于我国鸡群J亚型禽白血病的净化防制具有重要的现实意义。

发明内容

针对现有存在的上述问题，本发明提供了一种J亚群禽白血病免疫胶体金抗体检测试纸条，其中最主要的是采用了原核表达后纯化的J亚群禽白血病病毒表面蛋白偶联免疫胶体金，利用该胶体金可以快速检测血清中的J亚群禽白血病抗体，进而为鸡群J亚群禽白血病精准快速诊断提供技术保障。通过Western Blot检测表达的gp85蛋白能够与JE9单抗和抗HIS标签抗体发生特异性反应，表明具有良好的特异性。

本发明所采用的具体技术方案是：

通过比对临床病例，特别是混合肿瘤、单纯髓细胞瘤、血管瘤、纤维肉瘤、组织肉瘤、成红细胞瘤、肾瘤等病例，通过抗体及PCR检测确定ALV-J感染，DF-1细胞培养并分离病毒，比对分析各病毒表面蛋白的关键保守基因序列，最终确定采用ALV-J gp85基因片段，并根据上述表面蛋白的关键保守基因序列设计引物扩增保守序列，最终原核表达的SU蛋白制备试纸条，所获得的试纸条可以完全实现J亚群禽白血病的精准诊断。

其具体过程如下：

根据现有的ALV-J设计特异性引物，所述的正向引物为5’-GCGGATCCATCAAGAACGGAACAACACG-3’，含BamHⅠ酶切位点，其基因序列如SEQ ID NO.2所示；反向引物为5’-GCGCGCAAGCTTGTCCCCACAAATCAAGAAAATA-3’,含Hind III酶切位点，其基因序列如SEQ ID NO.3所示。

利用上述一对引物以J亚群禽白血病病毒的DNA为模版进行PCR扩增，其中优选采用NXO1O1(ALV-J,DQ115805.1)的DNA为模板；

PCR反应条件为：95℃5min，充分变性后进入循环体系：95℃40s，65℃1min，72℃1min，循环35次后72℃延伸10min。

扩增产物测序，其基因序列如SEQ ID NO.1所示；