[发明专利]一种新型感受态细胞的制备方法及其转化步骤

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种新型感受态细胞的制备方法及其转化步骤。

背景技术

感受态细胞是指经过适当处理后容易接受外来DNA进入的细胞，可以将外源DNA分子引入其中，使之获得新的遗传性状。感受态细胞转化效率直接影响前后试验的进展和工作效率，而感受态细胞的状态是影响转化效率最直接、关键的因素之一。目前，感受态的感受效率最关键的是需要冷藏，刚制备的感受态细胞其感受效果最好，但是随着时间的延长感受效果会逐渐下降。而且转化过程十分繁琐，需要热激反应、长时间培养以及一系列的增长步骤，大大降低了实验效率。因此研究一种增加冻融耐性、转化效率高、操作简单实用及能长期保存的感受态细胞及相对应的高效转化方法，对分子生物学的研究有很大帮助。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型感受态细胞(以下称C-competent cell)的制备方法及其转化步骤。

本发明所述C-competent cell在制备过程中采用氯化物混合物洗涤，增加了细胞的通透性，在转化过程中无需要热激反应，无需长时间培养，无需增长的步骤。

本发明所述C-competent cell的转化过程仅需1min，只需要将DNA和感受态细胞混合即可。简单的操作过程适合于自动化。

本发明所述C-competent cell具有很高的转化效率，转化效率高达10⁸-10⁹cfu／ug质粒DNA。

本发明所述C-competent cell增加了冻融耐性且具有现制的、消毒的、随时可用等特点。

本发明所述的C-competent cell的制备过程通过下列步骤实现的：

1)将大肠杆菌DH5α保存液涂布在无抗生素LB平板上，37℃过夜培养；挑取单克隆细菌至10ml LB培养基37℃振荡过夜；按1％(v／v)比例接种至100ml LB培养基中。

2)37℃剧烈振荡培养基，使其在600nm OD值为0.4-0.6。

3)预冷培养基，4℃、4000r／min离心10min收集细菌。

4)用缓冲洗液1重悬细菌，冰上孵育数分钟；4℃、4000r／min离心10min收集细菌。

5)用缓冲洗液2重悬细菌，冰上孵育数分钟；4℃、4000r／min离心10min收集细菌，100ul／管分装，-80℃、贮存备用。

其中缓冲洗液1为包含以下成分的水溶液：氯化镁(10mM-1M，优选为：50mM)，氯化钾(10mM-1M，优选为：20mM)，氯化钙(10mM-1M，优选为100mM)，葡萄糖(0.1-5％，优选为l％)，4-羟乙基哌嗪乙磺酸(10mM-100mM，优选为20mM)，调pH至6.5。

缓冲洗液2为包含以下成分的水溶液：氯化钙(10mM-1M，优选为30mM)，氯化钠(10mM-1M，优选为50mM)，氯化铁(10mM-1M，优选为30mM)，DMSO(5-30％，优选为10％)，调pH至7.0。

本发明所述的C-competent cell的转化过程通过下列步骤实现的：

1)从-80。℃取出1管C-competent cell置于冰上。

2)约1／3C-competent cell解冻时加入1-5μl待转入质粒DNA，其中质粒DNA体积不应超过C-competent cell体积的5％，轻轻混合几秒钟，混合过程中注意避免C-competent cell在室温放置时间过长。

本发明提供的C-competent cell转化效率高、增加冻融耐性，该感受态细胞的转化过程操作简便，重复性好、效率高，能满足分子生物学实验要求，是一项实用有效的技术，具有较高的应用价值。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步阐述。

实施例1：本发明所述C-competent cell的转化时间及转化效率检测。

本实施例中所用的材料和试剂如下：

材料：pUC18质粒、受体菌DH5α

试剂：LB液体培养基：蛋白栋10克，酵母提取物5克，氯化钠10克，硫酸镁2.4克，蒸馏水定容至1000ml，PH7.0，121℃灭菌20min。

缓冲洗液1为包含以下成分的水溶液：50mM氯化镁，20mM氯化钾，100mM氯化钙，1％葡萄糖，20mM4-羟乙基哌嗪乙磺酸，调节pH至PH6.5。