[发明专利]一种新型感受态细胞的制备方法及其转化步骤

权利要求书

1.新型感受态细胞(简称C-competent cell)的制备过程，步骤包括大肠杆菌培养，离心收集细菌，先后用两种溶液重悬细菌后收集细菌，分装，备用。

2.权利要求1的制备过程，其中两次重选细菌所用溶液分别为缓冲洗液1、缓冲洗液2，缓冲洗液1为包含以下成分的水溶液：氯化镁(10mM-1M)，氯化钾(10mM-1M)，氯化钙(10mM-1M)，葡萄糖(0.1-5％)，4-羟乙基哌嗪乙磺酸(10mM-100mM)，调PH值至6.5；缓冲洗液2为包含以下成分的水溶液：氯化钙(10mM-1M)，氯化钠(10mM-1M)，氯化铁(10mM-1M)，DMSO(5-30％)，调PH值至7.0。

3.权利要求1的制备过程，具体过程为：

将大肠杆菌DH5α保存液涂布在无抗生素LB平板上，37℃过夜培养；挑取单克隆细菌至10ml LB培养基37℃振荡过夜；按1％(v／v)比例接种至100ml LB培养基中，37℃剧烈振荡培养基，使其在600nm OD值为0.4-0.6；预冷培养基，4℃、4000f/min离心10min收集细菌，用缓冲洗液1重悬细菌，冰上孵育3分钟；4℃、4000r／min离心10min收集细菌，用缓冲洗液2重悬细菌，冰上孵育3分钟；4℃、4000r／min离心10min收集细菌，100ul／管分装，-80℃、贮存备用。

其中两次重悬细菌所用溶液分别为：

缓冲洗液1为包含以下成分的水溶液：50mM氯化镁，20mM氯化钾，100mM氯化钙，1％葡萄糖，20mM4-羟乙基哌嗪乙磺酸，调pH至PH6.5；

缓冲洗液2为包含以下成分的水溶液：30mM氯化钙，50mM氯化钠，30mM氯化铁，10％DMSO，调pH至PH7.0。

4.按照权利要求1-3的方法制备的新型感受态细胞(C-competent cell)。

5.按权利要求1—3的方法制备的C-competent cell的转化过程，步骤包括在冰上解冻C-competent cell，至解冻1／3时加入待转入质粒DNA，混匀，转化克隆涂板培养。

6.权利要求5的转化过程，其具体转化克隆为转入质粒DNA的C-competent cell。

7.权利要求5的转化过程，其具体步骤为：

a)从-80℃取出1管C-competent cell置于冰上。

b)约1／3C-competent cell解冻时加入1-5μl待转入质粒DNA，其中质粒DNA体积不应超过感受态细胞体积的5％，轻轻混合5秒钟，混合过程中注意避免C-competent cell在室温放置时间过长。

8.权利要求5-7的转化方法，其中大肠杆菌为大肠杆菌DH5α。