[发明专利]一种猪流行性腹泻和大肠埃希氏菌二联疫苗

说明书

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种猪流行性腹泻和大肠埃希氏菌二联疫苗。

背景技术

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒引起的猪的一种高度接触性肠道传染病，以呕吐、腹泻和食欲下降为基本特征，本病对不同年龄的猪均易感，尤其哺乳仔猪危害最严重，是一种高度接触性传染病。该病于1971年首发于英国，20世纪80年代初我国陆续发生本病。近几年，全国猪流行性腹泻呈爆发流行，给养殖业造成了巨大的经济损失。该病感染目前还没有有效的治疗方法，主要是以疫苗免疫预防为主。目前，国外主要是韩国的弱毒苗，国内主要是哈兽研研制的猪传染性胃肠炎等疫苗，但临床应用效果不佳。

另外，仔猪黄痢是由特定O抗原型的致病性大肠埃希氏菌（E.coli）引起的初生仔猪的以下痢为特征的传染病。该病主要导致1周龄内（主要是1～3日龄）仔猪发病，以排出黄色水样粪便和渐进性死亡为特征，是影响规模化种猪场和农村散养猪仔猪成活率的重要疾病。但目前市场上并没有有效的预防猪流行性腹泻和仔猪黄痢的疫苗。

发明内容

本发明的目的是提供一种猪流行性腹泻和大肠埃希氏菌二联疫苗，从而弥补现有技术的不足。

本发明的猪流行性腹泻和大肠埃希氏菌二联疫苗，包含有抗原和疫苗佐剂，其中抗原是保藏编号为CGMCC No.8503的猪流行性腹泻病毒和大肠埃希氏菌K88、K99、987P的纤毛抗原。

所述的疫苗佐剂为氢氧化铝胶佐剂。

上述的二联疫苗中猪流行性腹泻病毒含量≥10^6.0TCID₅₀/ml，K88纤毛抗原含量≥100个抗原单位/ml、K99纤毛抗原含量≥50个抗原单位/ml、987P纤毛抗原含量≥50个抗原单位/ml。

本发明的二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

（1）制备Vero细胞，生长液为含8%新生牛血清的MEM，当细胞长成单层后接种猪流行性腹泻病毒；

（2）取猪流行性腹泻病毒SD10株按1%接种量接种到Vero细胞单层，置37℃吸附1.5小时，加含2%新生牛血清MEM维持液继续培养；

（3）接毒后，当细胞病变达75%以上时收获病毒液，反复冻融3次；

（4）取冻融后的病毒液测定病毒含量，每0.1ml病毒含量不低于10^5.0TCID₅₀；

（5）将检验合格的细胞毒液置于灭菌容器内，加入10%福尔马林溶液至终浓度为0.2%，37℃灭活18小时；

（6）按发酵罐容积70%（V/V）加入Minca液体培养基，同时按培养基0.1%（V/V）加入消泡剂，通入高温蒸汽灭菌30分钟，待培养基温度降至35～37℃，按3%（V/V）向发酵罐中加入种子培养物，调节培养温度至37℃，调节融氧浓度至35%，培养5～7小时分别制备含K88纤毛抗原的大肠埃希氏菌C83549菌株的菌液、含K99纤毛抗原的大肠埃希氏菌C83644菌株的菌液和含987P纤毛抗原的大肠埃希氏菌C83710菌株的菌液；

（7）各菌株发酵培养菌液经管式离心机10000r/min离心30分钟，收获的菌泥按0.1g/ml比例重新悬浮于生理盐水中。采用剪切机对在58～65℃对含不同纤毛抗原的大肠埃希氏菌的菌悬液按5000～6000r/min的剪切强度剪切20～25分钟分别进行各纤毛抗原的提取；

（8）按每1ml成品苗中，K88纤毛抗原含量≥100个抗原单位、K99纤毛抗原含量≥50个抗原单位、987P纤毛抗原含量≥50个抗原单位，配制混合纤毛液；

（9）将（5）中的病毒溶液和（8）中的混合纤毛液例混合后，与疫苗佐剂混合制备成疫苗。

本发明的猪流行性腹泻、大肠埃希氏菌二联灭活疫苗免疫原性好，免疫后抗体产生快，产生的抗体滴度高且维持时间长，保存期长，免疫剂量小，选用的佐剂易于注射，可一针防治两种疾病，在配种前进行免疫注射可使怀孕母猪所产仔猪获得较好的被动免疫，使仔猪产生坚强的免疫力，能够抵抗强毒的攻击，提高仔猪的存活率。

具体实施方式